1. CONCEPTO, ALCANCE Y LUGAR DE LA HIBRIDACIÓN IN SITU

La hibridación in situ (ISH, in situ hybridization) es el conjunto de técnicas que detectan una secuencia concreta de ADN o ARN mediante una sonda de ácido nucleico complementaria, pero lo hacen sin separar esa secuencia de la célula y del tejido en los que se encuentra. Esta última idea es la esencia del método. Una PCR puede demostrar que existe una secuencia en un tubo; una ISH te permite afirmar, además, si la señal está en la célula neoplásica, en un linfocito acompañante, en el núcleo, en el citoplasma o en una subpoblación espacialmente delimitada. El valor añadido no es solo detectar: es detectar y localizar.

En Anatomía Patológica la ISH ocupa el punto de encuentro entre morfología, citogenética y patología molecular. Conserva la arquitectura tisular como la inmunohistoquímica (IHQ), pero interroga ácidos nucleicos en vez de proteínas. Puede aplicarse a cortes de tejido fijado e incluido en parafina, preparados citológicos, citobloques, extensiones, improntas, núcleos interfásicos y metafases, siempre que la combinación de muestra, fijador, sonda, pretratamiento y algoritmo de lectura haya sido validada. Los estándares técnicos de CLSI y ACMG insisten en que la validación pertenece al sistema completo de ensayo, no a la sonda aislada [2] [3].

La técnica responde a preguntas diferentes según el diseño de la sonda:

• ¿Está presente una secuencia? Detección de ADN viral, ARN viral, transcritos celulares o cadenas ligeras de inmunoglobulina.
• ¿Cuántas copias hay? Aneuploidías, ganancias, amplificaciones y deleciones.
• ¿Se ha roto o reordenado un locus? Sondas break-apart, útiles cuando un gen admite múltiples socios de fusión.
• ¿Se han unido dos loci concretos? Sondas de fusión o de doble fusión, que exigen conocer ambos socios.
• ¿Qué células expresan un ARN? ISH de ARN convencional o con amplificación ramificada de señal.

La ISH no es una única prueba ni tiene un único punto de corte. FISH, CISH, SISH, EBER-ISH y una sonda break-apart para ALK comparten la complementariedad de bases, pero difieren en analito, marcaje, amplificación de señal, microscopio, controles y reglas de interpretación. Por eso es incorrecto memorizar un “protocolo universal de FISH”. La temperatura de desnaturalización, la digestión, el tiempo de hibridación, el lavado y el número de células a contar son parámetros específicos del ensayo validado y de sus instrucciones de uso.

Las clasificaciones WHO actuales convierten determinadas alteraciones moleculares en criterios esenciales o deseables para múltiples entidades. Sin embargo, la WHO define qué alteración caracteriza a la entidad; no sustituye la validación técnica del método empleado para demostrarla. El portal oficial de los WHO Blue Books confirma la transición de la serie a clasificaciones integradas histomoleculares y permite comprobar la edición vigente de cada órgano [1]. El patólogo debe unir ambos planos: escoger el biomarcador conforme a la clasificación vigente y escoger el ensayo conforme a su rendimiento, muestra y finalidad clínica.

2. FUNDAMENTO MOLECULAR: COMPLEMENTARIEDAD, DESNATURALIZACIÓN Y ASTRINGENCIA

2.1. La reacción de hibridación

Una sonda es una molécula de ADN, ARN o un análogo de ácido nucleico cuya secuencia es complementaria de la diana. Si la diana es ADN bicatenario, primero hay que separar sus dos hebras mediante desnaturalización. La sonda desnaturalizada puede entonces aparearse con la secuencia complementaria de la muestra. Durante la hibridación se forma un dúplex sonda-diana estabilizado por los puentes de hidrógeno entre bases complementarias y por interacciones de apilamiento. La señal visible procede del marcador unido directamente a la sonda o de un sistema que reconoce un hapteno incorporado en ella.

La complementariedad no funciona como un interruptor absoluto. Un dúplex con algún desajuste puede persistir si las condiciones son permisivas; uno perfectamente complementario puede perderse si el lavado es excesivamente exigente. El objetivo técnico es situar el ensayo en una ventana en la que sobreviva la unión específica y se elimine la inespecífica. Esa capacidad de discriminar se expresa mediante la astringencia o stringency.

2.2. Temperatura de fusión y factores que estabilizan el dúplex

La temperatura de fusión o Tm es aquella en la que aproximadamente la mitad de los dúplex están disociados para unas condiciones definidas. No es una constante universal de “la FISH”: depende de la longitud y composición de la sonda, porcentaje GC, grado de complementariedad, concentración de sales y presencia de agentes desnaturalizantes. Las sondas largas y ricas en GC suelen formar dúplex más estables; los desajustes reducen su estabilidad. El fabricante y el laboratorio convierten estos principios en condiciones validadas de desnaturalización, hibridación y lavado.

La sal apantalla las cargas negativas de los fosfatos y estabiliza el dúplex; por eso, menos sal significa más astringencia. La formamida reduce la estabilidad térmica del apareamiento y permite trabajar a temperaturas menores; a igualdad del resto de condiciones, aumentar su concentración incrementa la exigencia del lavado. La temperatura actúa en sentido directo: cuanto más se acerca o supera la ventana de estabilidad del dúplex, mayor es la selección contra los apareamientos imperfectos. CLSI MM07 incluye precisamente temperatura, composición de tampones y condiciones de lavado entre los parámetros que deben definirse y validarse [2].

2.3. Desnaturalización, hibridación y lavado no son intercambiables

La desnaturalización abre el ADN de la muestra y la sonda; si es insuficiente, la diana permanece inaccesible y el resultado será débil o negativo. Si es excesiva, deteriora la morfología nuclear y fragmenta el ADN. La hibridación permite que la sonda encuentre su diana; exige temperatura estable, cámara húmeda y prevención de la evaporación. El lavado posthibridación retira la sonda libre y los dúplex no específicos. Un fallo en cualquiera de los tres pasos puede producir “ausencia de señal”, pero el mecanismo y la solución son distintos.

También hay que separar sensibilidad analítica de especificidad de hibridación. Incrementar la concentración de sonda o amplificar la señal puede hacer visible una diana escasa, pero también eleva el fondo si el bloqueo y los lavados no son adecuados. Aumentar indiscriminadamente la astringencia puede limpiar el fondo a costa de borrar la diana. La optimización consiste en demostrar que la combinación elegida mantiene señal interpretable en controles de baja intensidad y conserva un fondo aceptable en negativos.

3. SONDAS Y ARQUITECTURAS DE ENSAYO

3.1. Qué debe conocerse de una sonda

La sonda no se define solo por el nombre del gen. Hay que conocer la región que cubre, el tamaño aproximado, el fluoróforo o hapteno, la posición respecto al punto de rotura, la sonda de referencia, los patrones válidos y atípicos, las limitaciones conocidas y la versión de las instrucciones de uso. Dos sondas “para EWSR1” pueden cubrir regiones distintas y no detectar exactamente el mismo espectro de reordenamientos. Un resultado negativo significa que no se ha demostrado la alteración que ese diseño puede detectar; no equivale a “el tumor carece de toda fusión”.

Las sondas pueden estar marcadas directamente con un fluoróforo o indirectamente con un hapteno —por ejemplo, digoxigenina— que después se revela mediante anticuerpos o sistemas enzimáticos. El marcaje directo acorta pasos y reduce variables; el indirecto permite amplificación de señal. El coste de amplificar es añadir reacciones capaces de introducir fondo, precipitado excesivo o variabilidad.

3.2. Sondas de enumeración y de locus

Las sondas centroméricas o de enumeración cromosómica reconocen secuencias repetitivas próximas al centrómero y se usan como referencia de número cromosómico. Las sondas de locus específico reconocen una región génica concreta. Su combinación permite comparar la diana con una referencia: por ejemplo, una sonda para ERBB2 y otra para CEP17. El cociente ayuda a distinguir una amplificación focal de un aumento más general del número de copias, pero tampoco convierte CEP17 en un sinónimo perfecto de “número de cromosomas 17”. La interpretación debe seguir el algoritmo específico del tumor y del ensayo.

En deleciones se combina una sonda de la región diana con otra de control. La pérdida aparente de una señal aislada puede deberse a truncamiento nuclear: un corte histológico contiene solo parte del núcleo. Por eso los puntos de corte se establecen con muestras normales procesadas del mismo modo y no mediante la expectativa teórica de “dos señales en toda célula”. La revisión de los requisitos CAP para ISH subraya la necesidad de rangos normales porque el corte produce pérdidas aparentes y el solapamiento nuclear puede producir ganancias aparentes [2] [3].

3.3. Sondas break-apart

Una sonda break-apart emplea dos fluoróforos situados a ambos lados de un locus. En un alelo no reordenado, las señales están superpuestas o tan próximas que se observan fusionadas. Cuando el locus se rompe por un reordenamiento, las señales se separan por encima del criterio espacial validado. El diseño es independiente del socio: demuestra que el gen está reordenado, pero normalmente no identifica con qué gen se ha fusionado.

El patrón clásico de una célula con un alelo normal y otro reordenado es una señal fusionada más una señal de cada color separadas. Pueden existir patrones variantes —pérdida aislada de uno de los extremos, múltiples copias, señales desiguales o distancias limítrofes— que exigen reglas propias del producto y, a veces, una técnica ortogonal. La ficha autorizada por la FDA del ensayo ALK break-apart confirma su finalidad: detectar reordenamientos que afectan a ALK en tejido FFPE, no identificar de forma automática el socio EML4 [8].

3.4. Sondas de fusión y doble fusión

Las sondas de fusión asignan colores distintos a dos genes conocidos. La proximidad o superposición de ambos colores indica que los loci han quedado yuxtapuestos. Son muy específicas para una pareja concreta y pueden distinguir determinados falsos patrones mediante configuraciones de doble fusión. Su limitación es simétrica a la ventaja de las break-apart: si el gen se fusiona con un socio no cubierto, el ensayo será negativo aunque exista un reordenamiento real.

3.5. Sondas de ADN, ARN y análogos

Las sondas de ADN son robustas para número de copias y reordenamientos. Las ribosondas pueden detectar transcritos, pero el ARN diana es más lábil y exige control de integridad. Las sondas PNA o LNA emplean esqueletos modificados que alteran la afinidad y la cinética. En infección por Epstein-Barr, las sondas frente a EBER detectan ARN nuclear abundante; la metodología se considera de elección para localizar EBV en cortes tisulares [12]. En plataformas de amplificación ramificada de ARN, pares de oligonucleótidos deben unirse de forma cooperativa antes de construir el árbol amplificador, lo que combina sensibilidad con supresión de fondo. La descripción original de RNAscope en FFPE corresponde a Wang y colaboradores, 2012, PMID 22166544 [11].

4. TIPOS DE HIBRIDACIÓN IN SITU Y SISTEMAS DE DETECCIÓN

4.1. FISH: hibridación in situ fluorescente

En FISH la señal se observa mediante fluoróforos. Permite multiplexar colores, detectar señales puntiformes y evaluar su distancia, número y distribución. Es la modalidad natural para sondas break-apart, de fusión, enumeración y amplificación. La contratinción con DAPI delimita los núcleos y ayuda a identificar su integridad. La lectura requiere microscopio de epifluorescencia con filtros compatibles, fuente luminosa estable, objetivos adecuados, oscuridad ambiental controlada y, para documentar o analizar, cámara y programa de captura.

Sus ventajas son la alta resolución espacial de señales discretas, el multiplexado y la posibilidad de estudiar interfase y metafase. Sus inconvenientes son la menor familiaridad morfológica que el campo claro, la autofluorescencia, el desvanecimiento de fluoróforos, la dependencia de filtros y la necesidad de conservar imágenes representativas cuando la preparación pierde intensidad. La señal puede localizarse en diferentes planos del núcleo; el enfoque en eje Z es parte de la lectura, no un detalle opcional.

4.2. CISH: hibridación in situ cromogénica

En CISH la sonda se revela mediante una reacción enzimática que deposita un cromógeno visible en microscopio de campo claro. La morfología puede compararse con facilidad con la hematoxilina-eosina, las preparaciones son estables y el laboratorio puede aprovechar microscopios y escáneres convencionales. Un producto autorizado para HER2 CISH define expresamente su uso en tejido mamario FFPE y lectura en campo claro, demostrando que “cromogénica” no significa una técnica meramente investigadora [23].

El precipitado cromogénico puede ocultar señales individuales cuando la amplificación es muy intensa y ofrece menos canales simultáneos que FISH. Además, una reacción enzimática excesiva aumenta tamaño y difusión del depósito. Por tanto, su carácter permanente no elimina la necesidad de controlar tiempo de revelado, contraste y fondo.

4.3. SISH y dual-ISH

La SISH (silver-enhanced in situ hybridization) utiliza depósito de plata para generar señales oscuras y permanentes en campo claro. Puede combinarse con un segundo marcador cromogénico para valorar simultáneamente gen y referencia. En la práctica, CISH y SISH comparten la ventaja de integrar señal y morfología con equipamiento de campo claro, aunque la química de revelado y la apariencia de las señales difieren.

4.4. ISH de ARN, EBER-ISH y amplificación ramificada

La RNA-ISH detecta transcritos y conserva su distribución celular. En EBER-ISH, el resultado debe localizarse en las células relevantes; una positividad en linfocitos acompañantes no convierte automáticamente al tumor en asociado a EBV. Antes de informar un resultado negativo, un control de ARN celular debe demostrar que el ARN de la población diana está preservado. Las guías de interpretación en linfoma de Hodgkin recomiendan correlacionar la señal nuclear con la morfología y validar la integridad del ARN tumoral, PMID 11863222 [13].

Las técnicas de amplificación ramificada no multiplican necesariamente la diana; construyen una estructura de preamplificadores, amplificadores y sondas de señal sobre cada molécula reconocida. Esto evita algunos sesgos de la amplificación en tubo y mantiene la localización. La lectura puede ser cromogénica o fluorescente y admite multiplexado. El control positivo de un transcrito constitutivo y el negativo de una secuencia ausente son imprescindibles para distinguir degradación de ARN, fondo y verdadera ausencia de expresión.

4.5. Modalidades históricas y complementarias

La ISH radioactiva tuvo gran sensibilidad, pero su manejo, tiempo de exposición y requisitos de radioprotección limitaron su uso diagnóstico rutinario. El pintado cromosómico, la FISH multicolor y la hibridación espectral son útiles para reordenamientos complejos, sobre todo en metafase. La hibridación genómica comparada (CGH) y los arrays basados en hibridación interrogan ganancias y pérdidas a escala genómica, pero no preservan la localización celular del mismo modo que una ISH sobre corte; no deben confundirse por compartir el principio químico de complementariedad.

5. FASE PREANALÍTICA Y REQUISITOS DEL PROCESAMIENTO

5.1. La pregunta correcta empieza antes de cortar

La optimización comienza con la indicación. Antes de elegir bloque hay que saber qué alteración se busca, si el resultado será diagnóstico, pronóstico o predictivo, qué cantidad y distribución de lesión hay y qué métodos alternativos existen. El patólogo revisa la hematoxilina-eosina, marca el área relevante y estima celularidad, necrosis, inflamación y heterogeneidad. En muestras pequeñas debe coordinar IHQ, ISH y secuenciación para no agotar el bloque.

Un bloque grande no es necesariamente el mejor. Es preferible uno con células diana bien conservadas, poco tejido necrótico, mínima cauterización y una interfaz morfológica inequívoca. En HER2, por ejemplo, la heterogeneidad obliga a revisar toda la preparación y a dirigir el recuento a la población de interés; el algoritmo ASCO-CAP 2023 exige correlación con IHQ en los grupos infrecuentes [6].

5.2. Isquemia y fijación

La fijación debe conservar morfología y ácidos nucleicos sin volverlos inaccesibles. La formalina neutra tamponada es el estándar del tejido FFPE, pero su rendimiento depende de penetración y tiempo. La infrafijación favorece autólisis y pérdida de arquitectura; la sobrefijación aumenta entrecruzamientos y puede dificultar el acceso de la sonda. Los fijadores ácidos, mercuriales o alcohólicos no se intercambian sin validación. Una muestra procesada fuera de las condiciones validadas puede generar un resultado indeterminado, aunque el control externo del lote sea correcto.

Para HER2 en mama existe un dato duro que no debe generalizarse a toda ISH: ASCO-CAP 2023 reafirma fijación en formalina neutra tamponada al 10% durante 6-72 horas, mínima demora hasta la fijación, seccionado macroscópico de la pieza a intervalos de 5-10 mm y documentación de excepciones; también aconseja no usar idealmente cortes realizados más de seis semanas antes, con dependencia de almacenamiento y fijación [6]. Son requisitos del algoritmo HER2 mamario vigente, no una receta universal para EBER, ALK o una sonda de sarcoma.

5.3. Inclusión, corte y adhesión

La inclusión en parafina debe evitar calor y tiempos innecesarios que fragmenten ácidos nucleicos. El espesor de corte se ajusta al ensayo validado: si es excesivo, aumentan núcleos superpuestos, autofluorescencia y señales en varios planos; si es demasiado fino, crece el truncamiento y la pérdida aparente de copias. Los portaobjetos cargados positivamente y un secado adecuado reducen desprendimientos durante pretratamiento y lavados. Los pliegues, la compresión del microtomo y la contaminación cruzada entre bloques alteran la interpretación.

Conviene acompañar la ISH con un corte de referencia próximo. En neoplasias heterogéneas, separar demasiado el corte de ISH del H&E o de la IHQ puede hacer que la población marcada ya no exista en el nivel analizado. La trazabilidad debe relacionar solicitud, bloque, nivel, sonda, lote, operador, plataforma, control e imagen.

5.4. Descalcificación

Los ácidos fuertes degradan ácidos nucleicos y limitan FISH, RT-PCR y NGS. Los protocolos CAP para tumores óseos recomiendan, cuando sea posible, reservar tejido no descalcificado o emplear EDTA/condiciones validadas, dejando la descalcificación ácida pura como una amenaza para las pruebas moleculares [14]. Un estudio prospectivo de 2021 no halló cambios significativos en HER2 FISH tras EDTA en su serie, PMID 34461131, pero este dato valida aquella combinación experimental y no cualquier tiempo de EDTA o cualquier ensayo [15].

5.5. Citología, citobloques y otros preparados

La citología puede ser una excelente fuente porque ofrece núcleos enteros y evita el truncamiento del corte, pero introduce fijadores y soportes distintos. Extensiones teñidas, citocentrifugados, citobloques y líquidos no son matrices equivalentes. La FDA autorizó el ensayo ALK break-apart para tejido FFPE de carcinoma pulmonar; ampliar su uso a extendidos o citobloques requiere validación local de esa matriz [8]. En la práctica, los citobloques formalinizados se integran mejor en circuitos histológicos, mientras los extendidos permiten correlación célula a célula si se marca el área.

En preparaciones celulares hay que controlar superposición, pérdida de células durante lavados, envejecimiento del vidrio, destinción y autofluorescencia del colorante previo. Para hematología, la FISH en interfase puede aplicarse a suspensiones celulares; para alteraciones que requieren arquitectura, el corte de tejido conserva una ventaja decisiva.

5.6. ARN: una preanalítica más exigente

El ARN se degrada con rapidez y exige evitar demoras, RNasas, calor y condiciones de fijación no validadas. Un control positivo externo solo demuestra que el reactivo funcionó en otro tejido. Para interpretar un caso negativo necesitas un control de ARN en las células del propio caso, preferentemente un transcrito constitutivo con abundancia comparable a la diana. Si ese control falla, el resultado no es “negativo”: es no interpretable.

6. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO, PASO A PASO

El flujo general es estable, pero sus condiciones concretas deben proceder de la validación y de las instrucciones vigentes del ensayo. La siguiente secuencia sirve para entender qué persigue cada paso y qué ocurre si falla.

1. Revisión y marcado del área. El patólogo selecciona la población diana en H&E o IHQ. Sin este paso, un recuento técnicamente perfecto puede medir estroma, inflamación o necrosis.
2. Desparafinado y rehidratación. La parafina residual impide acceso homogéneo de reactivos. El secado de la sección durante fases acuosas favorece fondo y desprendimiento.
3. Pretratamiento térmico o químico. Revierte parte de los entrecruzamientos, facilita penetración y ajusta accesibilidad del ácido nucleico. Un pretratamiento insuficiente da señales débiles; uno excesivo destruye morfología.
4. Digestión proteolítica. Proteasas exponen la diana. La infradigestión retiene una barrera proteica; la sobredigestión borra límites nucleares y desprende tejido.
5. Desnaturalización. Se separan hebras de diana y sonda. Exige temperatura y tiempo precisos y control de evaporación.
6. Aplicación de sonda e hibridación. El cubreobjetos reparte el volumen; la cámara húmeda evita concentración por evaporación. Temperatura inestable altera cinética y especificidad.
7. Lavado posthibridación. Ajusta la astringencia mediante temperatura, sal y, cuando corresponde, formamida. Retira sonda libre y apareamientos imperfectos.
8. Detección. En marcaje directo se conserva el fluoróforo; en indirecto se aplican anticuerpos, polímeros, enzimas, cromógenos o plata. Cada capa añade sensibilidad y una posible fuente de fondo.
9. Contratinción y montaje. DAPI en fluorescencia o una contratinción nuclear ligera en campo claro permiten reconocer células sin ocultar la señal.
10. Lectura, documentación e informe. Se comprueban controles, se recorre toda la preparación, se seleccionan áreas, se cuentan las células requeridas, se revisan patrones atípicos y se documenta la conclusión.

6.1. Automatización

Las plataformas automatizadas pueden estandarizar desparafinado, pretratamiento, aplicación de sonda, hibridación, lavados y detección. Reducen variación manual y mejoran trazabilidad, especialmente en CISH/SISH y RNA-ISH. Sin embargo, la automatización no compensa una mala selección del bloque, un tejido agotado ni un algoritmo inadecuado. Tampoco elimina la validación de cada sonda y matriz. Cambiar plataforma, reactivo crítico, método de recuperación, software de recuento o tipo de muestra puede exigir verificación o revalidación según el impacto.

6.2. Qué variables registrar

El registro técnico debe permitir reconstruir el ensayo: fecha, bloque y nivel; tipo de muestra y fijador; descalcificación; grosor validado del corte; lote y caducidad de sonda; programa de pretratamiento; proteasa; temperaturas; tiempos; lavados; plataforma; control positivo y negativo; operador; observador; número de células; resultado bruto; criterio de corte; imágenes y versión del algoritmo. Esta información no tiene que aparecer íntegra en el informe clínico, pero sí debe estar disponible para trazabilidad, auditoría y análisis de incidencias.

7. EQUIPAMIENTO, REACTIVOS, SEGURIDAD Y ORGANIZACIÓN

7.1. Área de preparación y procesamiento

El circuito básico requiere microtomo y consumibles libres de contaminación, portaobjetos cargados, estufa o sistema de secado, cubetas de desparafinado, baños termostatizados o módulos de pretratamiento, cámara húmeda, dispositivo de desnaturalización/hibridación con control preciso de temperatura y estaciones de lavado. Puede emplearse una plataforma automatizada o un hibridador independiente. Termómetros y sondas de temperatura deben estar verificados; una pantalla que marque la temperatura programada no demuestra por sí sola la temperatura real sobre la preparación.

Los reactivos incluyen sonda, tampón de hibridación, soluciones SSC u otras sales, agentes de bloqueo, proteasa, reactivos de detección, contratinción y medio de montaje. Deben almacenarse conforme a su ficha, protegerse de la luz cuando proceda y registrarse por lote y caducidad. La contaminación con nucleasas es especialmente crítica en RNA-ISH.

7.2. Lectura de FISH

El microscopio de epifluorescencia debe disponer de una fuente de excitación estable, filtros individuales y combinados compatibles con DAPI y los fluoróforos del ensayo, objetivos de alta apertura numérica y sistema de enfoque fino. La cámara digital y el programa de captura permiten documentar planos, superponer canales y archivar campos. El análisis automatizado puede asistir en localización y recuento, pero el observador debe revisar segmentación, exclusión de núcleos superpuestos y clasificación de señales.

La fuente luminosa envejece, los filtros se deterioran y la cámara puede generar ruido. El control del equipo abarca intensidad, uniformidad, alineación, exposición, balance de canales, calibración y mantenimiento. Para evitar bleed-through, cada fluoróforo se comprueba con el filtro apropiado y con controles de canal. La habitación debe permitir controlar la luz ambiental, aunque las persianas —como ironizaba un distractor oficial— no modifican la astringencia química del lavado.

7.3. Lectura en campo claro

CISH, SISH y RNA-ISH cromogénica se leen con microscopio óptico convencional. Esta compatibilidad facilita correlación morfológica, consulta entre patólogos y digitalización. El escáner debe estar validado para el tamaño y contraste de las señales si se pretende lectura digital primaria o análisis cuantitativo; que digitalice bien H&E no garantiza que resuelva puntos subcelulares pequeños.

7.4. Equipamiento reconocido en el contexto SEAP

La cartera de servicios de SEAP-IAP incluye ISH/FISH para detección de secuencias genéticas y enumera como dotación un microscopio de fluorescencia con filtros para FISH, sistema fotográfico y tratamiento de imágenes, ordenador y soporte específico [18]. Es una referencia útil para el contexto asistencial español, aunque los criterios clínicos de cada biomarcador deben actualizarse con la guía órgano-específica vigente.

7.5. Seguridad

El laboratorio debe evaluar formalina, xileno o sustitutos, formamida, ácidos, bases, enzimas, cromógenos y sales de plata conforme a sus fichas de datos de seguridad. Se requieren ventilación o cabina química cuando lo determine la evaluación, equipos de protección individual, gestión diferenciada de residuos y procedimientos ante derrames. La fluorescencia exige además proteger reactivos y ojos de fuentes intensas según el equipo. La seguridad química no se improvisa a partir de una receta técnica.

Los ensayos diagnósticos se encuadran en el Reglamento (UE) 2017/746 sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro y, en España, en el Real Decreto 942/2025, de 21 de octubre, que regula los IVD de uso humano y sus accesorios [20] [21]. Para el sistema de calidad del laboratorio, la referencia vigente es ISO 15189:2022, adoptada como UNE-EN ISO 15189:2023 y modificada por A11:2024 [19].

8. LECTURA, RECUENTO, NOMENCLATURA E INFORME

8.1. Leer no es contar puntos al azar

La interpretación comienza en el corte de hematoxilina-eosina y no en el ocular del microscopio de fluorescencia. El patólogo delimita la población que responde a la pregunta clínica, comprueba que esa población persiste en el nivel de ISH y revisa la preparación completa a bajo aumento antes de seleccionar campos. Deben excluirse necrosis, pliegues, bordes resecos, zonas sobreprocesadas, núcleos superpuestos y áreas sin morfología reconocible. En una neoplasia heterogénea, elegir únicamente el campo con más señales sin aplicar el algoritmo validado introduce un sesgo de selección.

La señal se juzga por su localización, tamaño, intensidad, nitidez y relación con la célula diana. Una señal puntiforme dentro de un núcleo intacto no equivale a un depósito difuso sobre el tejido. En FISH hay que enfocar en diferentes planos Z: dos puntos que parecen fusionados en un plano pueden separarse en otro, y una señal aparentemente ausente puede encontrarse fuera del foco inicial. En CISH o SISH, un conglomerado de amplificación puede registrarse según la regla validada, pero no debe convertirse arbitrariamente en un número de puntos.

8.2. Recuento y denominadores

El número de células, la distancia que define separación, el modo de tratar conglomerados, el denominador y el punto de corte proceden de las instrucciones validadas o de la guía clínica aplicable. No existe un “mínimo de veinte células” universal para toda ISH. Como ejemplo concreto, el algoritmo ASCO-CAP 2023 para HER2 mamario exige explorar todo el portaobjetos, contar al menos 20 células en un área representativa de carcinoma invasivo y analizar por separado una segunda población contigua que constituya más del 10% de las células tumorales; en los grupos infrecuentes, el recuento adicional se integra con IHQ [5] [6].

En un ensayo de relación gen/referencia se calculan por separado la media de copias del gen, la media de señales de referencia y su cociente. El cociente no sustituye a los valores absolutos: una relación elevada puede originarse por pérdida del control, y una relación no elevada puede coexistir con muchas copias de ambos objetivos. La interpretación debe seguir el algoritmo completo, que puede combinar cociente, media de copias, patrón de IHQ y revisión por un segundo observador.

8.3. Patrones de reordenamiento

En una sonda break-apart, la definición de “separación” debe expresarse en diámetros de señal o en la distancia especificada por el ensayo, no por una impresión visual variable. Se cuentan núcleos evaluables y se clasifica cada uno como intacto, separado o patrón variante. Una señal fusionada más una roja y una verde separadas suele representar un alelo normal y uno reordenado; pero pérdidas aisladas de un extremo, múltiples copias y separación limítrofe requieren las reglas de la sonda. La positividad demuestra alteración del locus cubierto, no necesariamente el socio, la orientación, el marco de lectura ni la expresión de una proteína funcional.

En una sonda de fusión, una proximidad casual por superposición nuclear puede simular unión. Los diseños de doble fusión reducen algunos falsos positivos porque esperan señales recíprocas, aunque tampoco excluyen todos los patrones variantes. El resultado debe relacionarse con la prevalencia preanalítica, la morfología y la IHQ. Si la señal es atípica o se encuentra justo en el punto de corte, un segundo observador y una técnica ortogonal pueden ser más informativos que contar indefinidamente el mismo campo.

8.4. Nomenclatura

ISCN 2024 es la edición vigente del sistema internacional para nomenclatura citogenómica; la editorial publicó además una fe de erratas en 2026 [4]. En interfase, la fórmula puede comenzar por nuc ish, identificar las sondas y consignar el patrón y el número de núcleos. Por ejemplo, una notación del tipo nuc ish(ERBB2x19)[20] comunica una media o patrón de numerosas copias en los núcleos estudiados, pero la conclusión clínica de amplificación exige aplicar el algoritmo y control correspondientes. La nomenclatura no sustituye la interpretación ni debe inventarse si el ensayo comercial especifica otro modo de informe.

8.5. Contenido mínimo del informe

El informe debe ser inequívoco para el clínico y reproducible para el laboratorio. Identifica paciente, muestra, bloque, tumor y área examinada; especifica método y objetivo; describe resultado bruto suficiente —medias, cociente, porcentaje o patrón—; aplica el punto de corte y emite una conclusión. Cuando influya en la interpretación, registra fijador, descalcificación, celularidad, heterogeneidad, controles o limitaciones. También debe indicar la guía, versión de algoritmo o instrucciones de uso relevantes y, si el resultado es indeterminado, explicar por qué y qué alternativa se recomienda.

9. APLICACIONES DIAGNÓSTICAS, PRONÓSTICAS Y PREDICTIVAS

9.1. Alteraciones predictivas

La amplificación de HER2 es el ejemplo clásico de ISH predictiva. En carcinoma mamario invasivo, la prueba se integra con IHQ según ASCO-CAP 2023; en adenocarcinoma gastroesofágico se aplican criterios específicos de aquella localización [5] [9]. La señal espacial permite dirigir el recuento a tumor invasivo y reconocer heterogeneidad. La utilidad clínica no reside en “ver muchos puntos”, sino en clasificar el caso mediante un ensayo validado que guíe tratamiento anti-HER2.

En cáncer de pulmón no microcítico, FISH break-apart ha sido una prueba establecida para ALK y ROS1. El ensayo ALK aprobado por FDA detecta reordenamientos en tejido FFPE y exige controles positivos y negativos [8]. Las recomendaciones CAP/IASLC/AMP reconocen además IHQ y métodos moleculares dentro de estrategias de selección para inhibidores de tirosina cinasa [7]. El algoritmo contemporáneo puede priorizar paneles NGS por eficiencia y cobertura, pero la FISH conserva valor cuando se necesita una prueba dirigida, una confirmación ortogonal o el material no permite otra plataforma.

9.2. Sarcomas y tumores de partes blandas

Las sondas break-apart para EWSR1, SS18, DDIT3, FOXO1, FUS, CIC u otros loci pueden apoyar la clasificación de neoplasias fusionales. El diseño debe seguir a la hipótesis morfológica: EWSR1 reordenado aparece en entidades diferentes y no equivale por sí solo a sarcoma de Ewing. De modo inverso, una FISH EWSR1 negativa no excluye todos los sarcomas redondocelulares, porque CIC::DUX4, BCOR y otros grupos tienen biología distinta. La revisión de 2024 sobre detección de fusiones subraya la necesidad de combinar FISH, RT-PCR y secuenciación según arquitectura, socio y material [17].

La amplificación de MDM2, con frecuencia acompañada de CDK4, apoya el diagnóstico de tumor lipomatoso atípico/liposarcoma bien diferenciado y liposarcoma desdiferenciado en el contexto correcto. Aquí FISH suele superar a una IHQ aislada en especificidad para demostrar amplificación, pero tampoco sustituye el muestreo: la ausencia de alteración en un fragmento necrótico o no representativo no resuelve un tumor radiológica y morfológicamente sospechoso.

En el sarcoma fibromixoide de bajo grado, la morfología y la expresión intensa y difusa de MUC4 orientan a una neoplasia asociada habitualmente a FUS::CREB3L2. En la serie oficial de 2021, las preguntas 143-145 construyeron precisamente ese itinerario: diagnóstico, marcador inmunohistoquímico y demostración por FISH de t(7;16)/FUS-CREB3L2; la respuesta de la pregunta 145 fue la A. Es un buen ejemplo de integración escalonada de histología, IHQ e ISH, no de solicitud molecular a ciegas [17].

9.3. Tumores del sistema nervioso

La evaluación de 1p/19q ilustra por qué una técnica válida puede contestar una pregunta incompleta. Una FISH con sondas focales detecta pérdida de las regiones interrogadas, pero no demuestra por sí sola la codeleción completa de brazos derivada de la translocación no equilibrada característica. Pueden producirse falsos positivos por deleciones parciales; una serie publicada en 2020 documentó este riesgo, PMID 33205043 [10]. La clasificación integrada actual exige relacionar IDH, ATRX, histología y codeleción de brazos completos, para la que arrays, NGS con número de copias u otras técnicas genómicas pueden ser preferibles.

FISH también puede valorar EGFR, CDKN2A/B, MYC/MYCN y otros loci en contextos definidos. Sin embargo, que una alteración sea visible no significa que sea el marcador clasificatorio vigente. Antes de solicitar una sonda conviene formular la decisión que cambiará el resultado y consultar la edición WHO aplicable [1].

9.4. Hematolinfoide e infección

EBER-ISH es el método de referencia para localizar infección latente por EBV en tejido, porque los transcritos EBER son abundantes y nucleares [12]. Su interpretación es morfológica: deben identificarse las células positivas y diferenciar tumor, linfocitos reactivos y epitelio. En linfoma de Hodgkin clásico, la positividad debe observarse en células de Hodgkin/Reed-Sternberg y el control de integridad de ARN debe ser adecuado [13]. Los porcentajes de asociación varían con subtipo, edad, geografía e inmunidad; una cifra de examen no es una prevalencia universal.

La ISH para cadenas ligeras kappa y lambda de ARN puede demostrar restricción plasmocitaria cuando la IHQ es difícil por inmunoglobulina de fondo. FISH en neoplasias hematológicas detecta reordenamientos, deleciones y ganancias en núcleos interfásicos, pero el panel, el punto de corte y la nomenclatura pertenecen a la entidad y al laboratorio. La mayor sensibilidad de un panel amplio no compensa contar células de una población equivocada.

9.5. Mesotelioma y otras aplicaciones

La deleción homocigota de CDKN2A/p16 por FISH y la pérdida de BAP1 por IHQ son marcadores de malignidad útiles en proliferaciones mesoteliales. El consenso IMIG actualizado en 2023 y publicado en 2024 integra morfología, IHQ y pruebas moleculares, y recalca que la sensibilidad no es absoluta [16]. Por ello, la demostración de una alteración puede sostener malignidad en el contexto apropiado, mientras que su ausencia no convierte una lesión en benigna.

Otras utilidades incluyen detección de virus, aneuploidías, amplificaciones, deleciones, transcritos oncogénicos y expresión espacial de ARN. En microbiología tisular, localizar el microorganismo o su ácido nucleico dentro de la lesión ayuda a separar infección relevante de contaminación; aun así, la sonda solo detecta la secuencia cubierta. Una variante, carga baja o degradación puede causar negatividad y exige controles apropiados.

10. VALIDACIÓN, CONTROLES Y GARANTÍA DE CALIDAD

10.1. Validar el sistema completo

Antes de uso clínico, el laboratorio demuestra que el ensayo rinde para la finalidad prevista en sus matrices reales. La validación o verificación documenta exactitud/concordancia, precisión intraobservador e interobservador, sensibilidad y especificidad analíticas, límites de interpretación, reproducibilidad, estabilidad, tasa de fallos y robustez. CLSI MM07, segunda edición de 2013, proporciona el marco para desarrollar y validar ensayos de sondas de ácido nucleico; ACMG E9, publicado en 2011 y reafirmado en 2018 mientras se prepara una actualización, establece estándares técnicos para FISH [2] [3].

La serie debe abarcar negativos, positivos cercanos al punto de corte, positivos claros y patrones variantes, con suficiente diversidad de tejidos y fijación. Los casos limítrofes son especialmente valiosos: un método que solo reconoce amplificaciones masivas puede parecer perfecto en una colección sesgada. Cuando exista un método de referencia o laboratorio externo, se estudia concordancia y se resuelven discrepancias mediante revisión morfológica y método ortogonal.

10.2. Controles en cada ejecución

El control positivo demuestra que sonda, pretratamiento, hibridación y detección pueden producir señal. El negativo revela fondo y unión inespecífica. La sonda de referencia interna —por ejemplo, centromérica— informa sobre presencia de ADN evaluable y permite un cociente, aunque puede sufrir alteraciones biológicas propias. En RNA-ISH, una sonda constitutiva positiva es esencial para demostrar integridad del ARN; una sonda bacteriana o secuencia ausente puede servir como control negativo. Los controles internos en tejido del caso son particularmente potentes porque han compartido su preanalítica.

Un control comercial impecable no rescata un caso mal fijado. La aceptación de la corrida se separa de la aceptabilidad de cada caso. Si falla el control de corrida, los resultados asociados no se emiten; si el control funciona pero el caso no tiene señal de referencia o tejido diana, el caso es no concluyente. La reacción debe repetirse solo tras identificar una causa plausible o seleccionar otro bloque, porque repetir sin cambiar nada reproduce el mismo problema y consume tejido.

10.3. Criterios de rechazo y repetición

Para HER2 mamario, ASCO-CAP 2023 recomienda rechazar la preparación si los controles no son los esperados, si no pueden localizarse y contarse dos áreas apropiadas, si más del 25% de las señales son inescrutables, si más del 10% aparecen sobre el citoplasma, si la resolución nuclear es deficiente o si la autofluorescencia es intensa [6]. Estas cifras son criterios concretos del ensayo HER2, útiles para estudiar el principio de aceptabilidad pero no transferibles sin validación a ALK, EBER o CDKN2A.

Otros motivos de repetición son pérdida del tejido, ausencia de tumor en el nivel, señales demasiado débiles, exceso de fondo, tinción no celular, discordancia grave con morfología/IHQ o patrón no contemplado. La repetición puede incluir otro nivel, nuevo corte reciente, ajuste preanalítico validado, otro bloque, segunda muestra u otra técnica. Debe conservarse el resultado inicial y documentarse la razón del cambio.

10.4. Competencia, evaluación externa y gestión del cambio

La competencia abarca ejecución técnica, selección de área, reconocimiento de artefactos, recuento, cálculo e informe. Se evalúa periódicamente con casos conocidos, concordancia entre observadores y revisión de errores. Los ensayos clínicos deben participar, cuando esté disponible, en programas de evaluación externa de la calidad; el laboratorio analiza no solo aprobado/suspendido, sino la causa de cualquier desviación y su impacto en pacientes.

Cambiar fijador, plataforma, proteasa, sonda, lote con modificación de diseño, algoritmo, software, microscopio o escáner puede alterar el desempeño. Una evaluación de riesgo decide si basta una verificación acotada o hace falta revalidación. También se controla la versión documental: procedimiento, hoja de trabajo, cálculo y plantilla de informe deben cambiar juntos. Los protocolos oncológicos CAP se actualizan con fechas de publicación y entrada en vigor, por lo que conviene consultar siempre la versión vigente en lugar de reutilizar una copia local antigua [22].

11. ARTEFACTOS, ERRORES Y RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS

11.1. Ausencia o debilidad de señal

Una señal débil puede originarse en cualquier eslabón: pérdida de diana por isquemia, fijación o descalcificación; corte envejecido; desparafinado incompleto; recuperación insuficiente; desnaturalización defectuosa; concentración baja de sonda; evaporación; tiempo de hibridación corto; lavado demasiado astringente; deterioro del reactivo; filtros incorrectos o fuente luminosa débil. La secuencia diagnóstica empieza comparando control de corrida, control interno y señal de referencia. Si fallan todos, se investiga la corrida o el equipo; si solo falla el caso, se priorizan muestra y preanalítica.

En ADN-ISH, la ausencia simultánea de señales diana y referencia indica que no puede evaluarse el caso. En RNA-ISH, una sonda constitutiva negativa impide concluir que el transcrito buscado está ausente. Antes de incrementar indiscriminadamente la proteasa se revisan espesor, adhesión, fijador, edad del corte y temperatura real. La sobredigestión puede dar una aparente mejor penetración a costa de destruir núcleos y perder el tejido.

11.2. Fondo alto, autofluorescencia y señales espurias

El fondo difuso se asocia a desparafinado deficiente, tejido reseco, digestión excesiva, exceso de sonda, bloqueo insuficiente, lavado poco astringente o reacción cromogénica prolongada. La autofluorescencia puede proceder de colágeno, elastina, lipofuscina, sangre, fijadores o pigmentos; se diferencia de una señal verdadera observando varios filtros, distribución y morfología. Una señal específica mantiene tamaño, color y localización esperados; la autofluorescencia suele aparecer en varios canales y seguir estructuras tisulares.

Si el fondo aumenta en toda la corrida, se revisan lote, contaminación, lavado y plataforma. Si ocurre en un único tejido, se evalúan pigmento, necrosis, cauterio y fijación. Elevar temperatura, reducir sal o aumentar formamida incrementa la astringencia y puede limpiar uniones inespecíficas, pero solo dentro de la ventana validada. La solución correcta no es convertir cada incidencia en un protocolo nuevo para ese caso.

11.3. Truncamiento, solapamiento y agrupación de señales

En cortes FFPE solo se observa una fracción del núcleo. Una copia puede quedar fuera del plano y producir pérdida aparente; en sentido contrario, núcleos solapados o células poliploides pueden simular ganancia. El grosor uniforme y la selección de núcleos intactos reducen ambos efectos. Los controles y puntos de corte deben derivarse de material procesado de forma semejante, porque el porcentaje basal de señales “anormales” no es cero.

En amplificaciones intensas, los puntos pueden formar conglomerados. En reordenamientos, señales muy próximas pueden parecer fusionadas a bajo aumento o separadas en planos diferentes. La lectura debe emplear el objetivo, filtros y criterio espacial validados, con enfoque Z y, cuando sea necesario, captura de canales individuales. El análisis de imagen ayuda a documentar, pero una segmentación que fusiona núcleos vecinos automatiza el error en vez de eliminarlo.

11.4. Discordancia biológica o metodológica

Una discordancia entre IHQ e ISH puede reflejar heterogeneidad, nivel diferente, alteración postranscripcional, polisomía, pérdida de referencia, anticuerpo o sonda inadecuados, preanalítica o simplemente criterios de ensayo distintos. El abordaje ordenado revisa identidad, morfología, área marcada, controles, datos brutos, algoritmo y versiones; después repite sobre el mismo u otro bloque o emplea una técnica ortogonal. No se debe elegir automáticamente el resultado que “encaja mejor”.

Un resultado FISH negativo también puede ser biológicamente incompleto: la alteración puede usar un punto de rotura fuera de la sonda, corresponder a otro gen, ser una variante críptica o producirse a nivel de ARN. La pregunta 112 de 2025 ejemplifica este límite con todo su contexto: la imagen corresponde a una neoplasia profunda del muslo de un varón de 32 años; los marcadores epiteliales, linfoides y melanocíticos son negativos; CD99 es parcheado y focal; WT1, intenso; y EWSR1 no está reordenado. La fusión esperada era CIC::DUX4, demostrable mediante NGS (respuesta C). El negativo de una sonda no es el negativo de toda la familia diagnóstica.

12. INTEGRACIÓN CON IHQ, PCR Y NGS

12.1. Técnicas que responden preguntas distintas

La IHQ detecta una proteína y conserva morfología; la ISH detecta y localiza ADN o ARN; PCR/RT-PCR amplifica una secuencia conocida en un extracto; y NGS interroga simultáneamente múltiples genes, variantes, copias o fusiones según el diseño. Ninguna es universalmente superior. La elección depende de alteración, socios posibles, cantidad de tejido, calidad de ADN/ARN, tiempo de respuesta, prevalencia, terapia asociada y necesidad de localización.

12.2. Estrategias secuenciales y paralelas

Una estrategia secuencial usa primero una prueba rápida o de alta prevalencia y reserva otra para casos positivos, negativos discordantes o no concluyentes. Una estrategia paralela analiza varias dianas desde el inicio, reduciendo tiempo cuando cada resultado puede cambiar tratamiento. En muestras pequeñas, repetir FISH monogénicas consume cortes; un panel NGS puede ser más eficiente. En cambio, si solo se pregunta por una amplificación bien definida y el tejido es escaso, una ISH dirigida puede ser más rápida, más barata y preservar la relación con la morfología.

Las guías pulmonares CAP/IASLC/AMP y la práctica actual apoyan paneles multiplexados para cubrir múltiples dianas terapéuticas, pero mantienen la obligación de validar el método y resolver discordancias [7]. En ALK, una IHQ validada puede ser suficiente en ciertos algoritmos; la pregunta 19 de 2022 marcó como incorrecta la afirmación de que toda IHQ ALK positiva debía confirmarse obligatoriamente por otra técnica (respuesta C). El mensaje no es que nunca se confirme, sino que la necesidad depende del ensayo validado, el contexto y la discordancia.

12.3. Cuándo la técnica ortogonal aporta más

Una prueba ortogonal interroga la misma hipótesis mediante un principio distinto. FISH break-apart positiva y RNA-NGS pueden complementarse: la primera localiza el locus reordenado; la segunda identifica socio y transcrito expresado. IHQ puede demostrar la consecuencia proteica; un array puede establecer si una aparente pérdida focal representa un brazo cromosómico completo. La confirmación es especialmente valiosa en patrones atípicos, resultados cerca del punto de corte, baja probabilidad pretest o consecuencias terapéuticas irreversibles.

La ortogonalidad no exige concordancia ciega. Dos pruebas pueden medir fenómenos distintos y ambas ser técnicamente correctas. El informe integrador explica qué demostró cada una, qué limitación persiste y cuál es la conclusión según la clasificación o guía vigente. Si no se puede resolver, se conserva la incertidumbre en vez de forzar una etiqueta.

13. LO QUE YA HA PREGUNTADO EL SAS

La revisión de los exámenes oficiales disponibles de 2018, 2021, 2022 y 2025 muestra un patrón estable: el tribunal alterna fundamentos físico-químicos, selección de sonda, interpretación de patrones y aplicaciones órgano-específicas. Las ediciones de promoción interna o APES que reproducen el mismo examen no se contabilizan como preguntas independientes. Esta es la cartografía completa de las cuestiones directamente relacionadas con el tema, con la letra oficial y la corrección de vigencia cuando procede:

No se han incluido preguntas donde FISH aparece solo como distractor sin que la técnica sea el objeto real. Tampoco se duplican los ficheros que reproducen idéntico enunciado y respuesta. Este criterio evita inflar artificialmente la frecuencia y permite reconocer qué contenidos han sido realmente examinados.

14. REPASO DE ALTO RENDIMIENTO

14.1. Veinte ideas que deben quedar automáticas

1. ISH detecta una secuencia de ADN o ARN y conserva su localización celular o tisular.
2. La sonda, la muestra, el pretratamiento, la detección y el algoritmo forman un único sistema validado.
3. Más temperatura de lavado, menos sales o más formamida aumentan la astringencia.
4. Astringencia excesiva borra señal específica; astringencia baja mantiene fondo inespecífico.
5. Una sonda break-apart demuestra reordenamiento del locus, pero normalmente no revela el socio.
6. Una sonda de fusión identifica una pareja concreta, pero puede omitir socios alternativos.
7. FISH permite multiplexado y distancia entre señales; CISH/SISH facilitan correlación en campo claro.
8. RNA-ISH negativa solo es interpretable si un control de integridad de ARN funciona en las células relevantes.
9. La formalina neutra tamponada es habitual; tiempos y espesores se toman del ensayo, no de una receta universal.
10. En HER2 mamario, el intervalo 6-72 horas corresponde a ASCO-CAP 2023 y no se extrapola a toda ISH.
11. La descalcificación ácida daña ácidos nucleicos; conviene reservar tejido sin descalcificar o usar EDTA validado.
12. El corte demasiado grueso favorece solapamiento; el demasiado fino, truncamiento.
13. La lectura comienza con H&E, selección de área y revisión global de la preparación.
14. Los puntos de corte y número de células pertenecen a la combinación tumor-indicación-ensayo.
15. HER2 grupo 1: relación ≥2,0 y media ≥4,0; los grupos 2-4 se integran con IHQ.
16. Un control de corrida positivo no demuestra que el caso esté bien preservado.
17. “No interpretable” es preferible a un falso negativo cuando fallan referencia, control de ARN o morfología.
18. MDM2/CDK4, EBER, ALK, HER2 y CDKN2A son aplicaciones de examen, cada una con reglas propias.
19. FISH focal para 1p/19q no garantiza codeleción de brazos completos y puede dar falsos positivos.
20. La integración con IHQ, PCR o NGS se decide por la pregunta clínica y por lo que cada técnica realmente mide.

14.2. Algoritmo mental ante una preparación

14.3. Contrastes que suelen construir distractores

15. FUENTES, EDICIÓN Y VIGENCIA

Este tema se ha contrastado en agosto de 2026 con fuentes primarias, documentos regulatorios y guías de sociedades científicas. La edición se consigna porque los criterios de biomarcadores cambian: una letra correcta en un examen de 2018 puede requerir hoy una interpretación diferente. Para una decisión asistencial siempre debe comprobarse la versión local aprobada, la ficha del ensayo y la guía órgano-específica vigente.

1. WHO Classification of Tumours Editorial Board. WHO Classification of Tumours, serie vigente por órganos, 5.ª y 6.ª ediciones según volumen. IARC/WHO; consulta oficial agosto de 2026. Portal IARC de los Blue Books.
2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases, MM07, 2.ª ed. CLSI; 2013. Estado vigente consultado en 2026. Ficha oficial CLSI MM07.
3. American College of Medical Genetics and Genomics. Technical standards and guidelines for fluorescence in situ hybridization, E9; 2011, PMID 21738013; reafirmado en 2018, con actualización indicada en desarrollo en 2026. Registro PubMed y estado de documentos ACMG.
4. McGowan-Jordan J, Hastings RJ, Moore S, eds. ISCN 2024: An International System for Human Cytogenomic Nomenclature. Karger; 2024. Fe de erratas publicada en 2026. Sitio oficial ISCN y erratum.
5. College of American Pathologists. HER2 Testing in Breast Cancer: 2023 Guideline Update. Reafirma las recomendaciones de 2018 y añade comentario sobre HER2-low. Página oficial CAP.
6. CAP/ASCO. HER2 Breast Update Algorithms 2023 y Summary of Recommendations. Criterios dual-probe, integración IHQ, fijación y aceptabilidad. Algoritmos oficiales y resumen de recomendaciones.
7. CAP/IASLC/AMP. Guía molecular para selección de pacientes con cáncer de pulmón candidatos a terapias dirigidas; página activa consultada en 2026. Guía oficial CAP.
8. U.S. Food and Drug Administration. Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit, PMA P110012; indicación en NSCLC FFPE y documentación regulatoria. Base oficial FDA.
9. CAP/ASCP/ASCO. HER2 Testing and Clinical Decision Making in Gastroesophageal Adenocarcinoma; guía órgano-específica activa consultada en 2026. Página oficial CAP.
10. Ball MK et al. Frequency of false-positive FISH 1p/19q codeletion in adult diffuse astrocytic gliomas. 2020; PMID 33205043. Registro PubMed.
11. Wang F et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for FFPE tissues. 2012; PMID 22166544. Registro PubMed.
12. Gulley ML, Tang W. Laboratory assays for Epstein-Barr virus-related disease. 2013; PMID 23666702. Registro PubMed.
13. Gulley ML et al. Guidelines for interpreting EBER in situ hybridization and LMP1 immunohistochemistry in Hodgkin lymphoma. 2002; PMID 11863222. Registro PubMed.
14. College of American Pathologists. Protocol for the Examination of Resection Specimens From Patients With Ewing Sarcoma, versión 5.0.0.0; recomendaciones sobre preservación molecular y descalcificación. Protocolo CAP.
15. Washburn E, Tang X, Caruso C, Walls M, Han B. Effect of EDTA decalcification on estrogen receptor and progesterone receptor immunohistochemistry and HER2/neu fluorescence in situ hybridization in breast carcinoma. Hum Pathol. 2021;117:108-114. PMID 34461131. Registro PubMed.
16. Husain AN et al.; International Mesothelioma Interest Group. Guidelines for Pathologic Diagnosis of Mesothelioma: 2023 Update of the Consensus Statement From the International Mesothelioma Interest Group. Arch Pathol Lab Med. 2024;148(11):1251-1271. PMID 38586983. Registro PubMed.
17. Solomon JP. Practical Considerations for Oncogenic Fusion Detection and Reporting in Solid Tumors. J Appl Lab Med. 2024;9(1):116-123. PMID 38167769. Comparación de FISH, RT-PCR y NGS de ARN. Registro PubMed.
18. Sociedad Española de Anatomía Patológica. Cartera de servicios: ISH/FISH, microscopio de fluorescencia, filtros y tratamiento de imágenes. Consulta agosto de 2026. SEAP-IAP.
19. UNE. ISO 15189:2022, adoptada como UNE-EN ISO 15189:2023 y modificación A11:2024; requisitos para calidad y competencia. Información UNE.
20. Unión Europea. Reglamento (UE) 2017/746 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 5 de abril de 2017, sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro; texto consolidado consultado en 2026. EUR-Lex.
21. España. Real Decreto 942/2025, de 21 de octubre, por el que se regulan los productos sanitarios para diagnóstico in vitro. BOE-A-2025-21298.
22. College of American Pathologists. Current Cancer Protocols, repositorio oficial con fechas de publicación e implementación; consulta agosto de 2026. Repositorio CAP.
23. U.S. Food and Drug Administration. SPOT-Light HER2 CISH Kit, documentación PMA P050040. Documento oficial FDA.

15.1. Qué debe comprobarse antes de reutilizar el tema

Palabras clave: hibridación in situ; ISH; FISH; CISH; SISH; RNA-ISH; EBER; sonda; astringencia; formamida; desnaturalización; break-apart; sonda de fusión; amplificación; HER2; ALK; MDM2; CDK4; CDKN2A; BAP1; EWSR1; procesamiento FFPE; descalcificación; controles; validación; ISCN; NGS.