1. INTRODUCCIÓN: LA PATOLOGÍA MOLECULAR COMO PROCESO INTEGRADO

La Patología Molecular aplica el análisis de ADN, ARN y, en sentido amplio, de sus productos para responder preguntas diagnósticas, pronósticas, predictivas o de clasificación. En Anatomía Patológica no constituye un laboratorio separado de la morfología: su rasgo diferencial es que la pregunta molecular nace del tejido. Antes de extraer una molécula, el patólogo decide si la muestra representa la lesión, cuánto tumor contiene, qué componente debe analizarse, qué alteraciones pueden interferir y qué tecnología responde con suficiente validez clínica.

Este enfoque impide reducir el tema a una lista de técnicas. Una PCR impecable sobre un área sin tumor genera un resultado técnicamente correcto pero clínicamente inútil. Una variante detectada con miles de lecturas puede estar mal anotada si se usa un transcrito incorrecto. Un cociente espectrofotométrico aparentemente «puro» no garantiza que el ADN fijado en formol conserve fragmentos amplificables. La calidad molecular es, por tanto, la suma de preanalítica, analítica, bioinformática, interpretación y comunicación.

El epígrafe oficial del Tema 32, publicado en el BOJA de 12 de agosto de 2024 para esta categoría, recorre deliberadamente todo el circuito: estructura y flujo de la información, extracción y control de pureza, separación y transferencia, manipulación enzimática, amplificación, metilación y secuenciación. La forma más rentable de estudiarlo es conectar cada principio con una decisión del laboratorio. ¿Necesitamos demostrar una variante puntual conocida, cuantificar un transcrito, estudiar número de copias, detectar una fusión, valorar metilación o explorar simultáneamente muchos genes? La respuesta determina muestra, analito, enriquecimiento, controles, plataforma y modo de informar.

Las aplicaciones son numerosas: demostrar variantes somáticas o germinales; detectar reordenamientos, fusiones y alteraciones del número de copias; estudiar microorganismos; caracterizar clonalidad; medir expresión; evaluar inestabilidad o metilación; clasificar tumores y seleccionar terapias. Sin embargo, no toda alteración biológica es un biomarcador validado, ni todo resultado analítico tiene acción clínica. El patólogo debe distinguir cuatro niveles: validez analítica —el ensayo mide correctamente—, validez clínica —el hallazgo se asocia al estado clínico—, utilidad clínica —su uso mejora una decisión— y adecuación al caso —la indicación y la muestra son apropiadas—.

El laboratorio moderno combina técnicas dirigidas y multigénicas. PCR, qPCR y Sanger siguen siendo muy útiles cuando la diana está bien definida, se necesita rapidez o se quiere confirmar un resultado por un principio ortogonal. La secuenciación masiva permite interrogar múltiples regiones en paralelo y detectar poblaciones minoritarias, pero exige bibliotecas, métricas de cobertura, filtrado de artefactos, anotación y una validación bioinformática tan rigurosa como la fase húmeda. No existe una tecnología universalmente superior: existe una tecnología adecuada para una finalidad de uso validada.

Los exámenes oficiales han insistido en fundamentos que parecen elementales pero separan conceptos. En 2022, extraordinaria, pregunta 38, la transferencia de información de ADN a ARN fue identificada como transcripción, respuesta oficial A. En la pregunta 40 de la misma convocatoria, el ácido nucleico de partida de una RT-PCR fue ARN, respuesta oficial B. En 2018, libre, pregunta 26, la electroforesis horizontal en gel de agarosa se vinculó a la PCR a tiempo final, respuesta oficial C. Estas preguntas señalan el núcleo del tema: vocabulario preciso, dirección de los procesos y correspondencia entre técnica y analito.

Para datos duros deben utilizarse fuentes vigentes y con fecha. En 2026, el marco general de competencia es ISO 15189:2022; las especificaciones preanalíticas para ARN y ADN aislados de tejido fijado e incluido en parafina se encuentran en ISO 20166-1:2018 e ISO 20166-3:2018, confirmadas por ISO en 2024; la serie ISO 21474 aborda procesos multiplex, validación, interpretación e informe; y la tercera edición de CLSI MM09 es de 2023. Las recomendaciones profesionales de AMP y CAP complementan ese marco para secuenciación oncológica.

2. ADN, ARN Y FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA

2.1. Estructura del ADN

El ADN es un polímero de desoxirribonucleótidos. Cada nucleótido contiene una base nitrogenada —adenina, guanina, citosina o timina—, una desoxirribosa y fosfato. Los nucleótidos de una misma cadena se unen mediante enlaces fosfodiéster 3′-5′, creando un esqueleto azúcar-fosfato con polaridad. Por convención, una secuencia se escribe en dirección 5′→3′. Esta direccionalidad no es ornamental: las polimerasas añaden nucleótidos al extremo 3′-OH y sintetizan una nueva cadena en sentido 5′→3′.

Las dos cadenas de la doble hélice son antiparalelas y complementarias. Adenina se aparea con timina mediante dos puentes de hidrógeno y guanina con citosina mediante tres. Los enlaces covalentes del esqueleto mantienen cada cadena; los puentes de hidrógeno y el apilamiento de bases estabilizan su asociación. El examen de 2018, libre, pregunta 41, convirtió esta diferencia en una pregunta directa y señaló como correcta la opción B: guanina y citosina establecen tres enlaces por puente de hidrógeno.

La complementariedad permite replicar, amplificar, hibridar y secuenciar. Un cebador se une a una secuencia complementaria; una sonda reconoce su diana por hibridación; una cadena sirve de molde. La temperatura a la que un dúplex pierde su estructura depende, entre otros factores, de longitud, composición GC, complementariedad, concentración salina y presencia de desajustes. Por eso el diseño de cebadores y sondas no puede basarse solo en «encontrar una secuencia parecida».

En células humanas, el ADN nuclear se organiza con histonas en cromatina y se distribuye en cromosomas lineales; el ADN mitocondrial es circular y se encuentra en múltiples copias por célula. Las regiones codificantes representan solo una fracción del genoma. Promotores, potenciadores, intrones, regiones no traducidas y otros elementos reguladores pueden ser clínicamente relevantes. La nomenclatura de una variante debe indicar el nivel descrito —genómico, codificante, de ARN o proteico— y utilizar una secuencia de referencia estable.

2.2. Replicación

La replicación del ADN es semiconservativa: cada molécula hija conserva una cadena parental y sintetiza otra. En los orígenes de replicación se abre la doble hélice; helicasas separan cadenas, proteínas estabilizan el ADN monocatenario, primasas generan cebadores y ADN polimerasas extienden desde un 3′-OH. Como las cadenas son antiparalelas y la síntesis siempre avanza 5′→3′, una se copia de manera continua y la otra mediante fragmentos que después se procesan y unen.

Las polimerasas celulares coordinan síntesis y corrección de errores. La fidelidad depende de selección del nucleótido, actividad correctora y sistemas de reparación posteriores. Un error que persiste puede originar una variante. La PCR imita solo una parte del proceso: utiliza ciclos térmicos para separar cadenas y cebadores sintéticos para delimitar la región, pero no reproduce la compleja maquinaria cromosómica celular.

2.3. Transcripción y procesamiento del ARN

La transcripción produce ARN a partir de una plantilla de ADN. La ARN polimerasa reconoce regiones reguladoras, abre localmente el ADN y sintetiza ARN 5′→3′. En genes codificantes eucariotas, el transcrito primario se procesa mediante caperuza 5′, corte y poliadenilación 3′ y splicing, que elimina intrones y une exones. El splicing alternativo permite que un gen origine varios transcritos; por ello un ensayo de fusión o expresión debe especificar qué uniones exón-exón detecta.

El ARN contiene ribosa y uracilo en lugar de desoxirribosa y timina. Es químicamente más vulnerable a hidrólisis y a ribonucleasas ambientales. Esa fragilidad condiciona recogida, fijación, almacenamiento, extracción y controles. Analizar ARN tiene ventajas: las fusiones expresadas pueden demostrarse a través de su transcrito, los intrones ya no ocupan la biblioteca y puede estudiarse expresión. También tiene desventajas: degradación, variabilidad biológica, expresión insuficiente y necesidad de transcripción inversa o de bibliotecas específicas.

2.4. Traducción

La traducción convierte la secuencia de codones del ARN mensajero en una cadena de aminoácidos. El ribosoma lee el ARNm 5′→3′; los ARN de transferencia emparejan anticodón y codón y aportan el aminoácido correspondiente. El código genético es degenerado: varios codones pueden especificar el mismo aminoácido. Esta propiedad explica que una sustitución nucleotídica pueda ser sinónima.

Una variante sinónima no cambia el aminoácido codificado, pero no debe equipararse de forma absoluta a «sin efecto». Puede alterar splicing, estabilidad del ARN, uso de codones o regulación. En 2022, extraordinaria, pregunta 17, la definición examinada de mutación silenciosa fue la opción D: no cambia el aminoácido y, en el marco simplificado de la pregunta, no afecta a función. Para estudiar con rigor, conserva la primera parte como definición y trata la ausencia de efecto como algo que debe evaluarse, no suponerse.

2.5. Variantes, mutaciones y epigenética

El término variante describe una diferencia respecto a una referencia sin prejuzgar patogenicidad. «Mutación» se emplea en contextos históricos o funcionales, pero no significa un cambio transitorio. En 2022, extraordinaria, pregunta 52, la opción A era la afirmación incorrecta precisamente porque definía mutación como alteración transitoria de la secuencia. Un cambio estable del ADN puede ser germinal o somático; su significado depende de tipo, localización, contexto y evidencia.

Las variantes abarcan sustituciones, inserciones/deleciones, duplicaciones, alteraciones de número de copias, reordenamientos y cambios estructurales. Una sustitución puede ser sinónima, missense, nonsense o afectar splicing. Una inserción o deleción no múltiplo de tres produce cambio del marco de lectura; si mantiene el marco, añade o elimina aminoácidos sin desplazar los codones posteriores. Estas categorías predicen un mecanismo posible, pero no sustituyen la clasificación clínica.

La epigenética comprende modificaciones heredables durante la división celular que modulan expresión sin cambiar la secuencia de bases. La metilación de citosinas en contextos CpG, las modificaciones de histonas y la organización de cromatina son mecanismos principales. La hipermetilación de un promotor puede asociarse a silenciamiento, aunque el efecto depende del locus y del contexto. En 2021, libre, pregunta 19, el SAS aceptó la opción D, todas correctas: metilación del ADN, modificación de histonas y reversibilidad de alteraciones epigenéticas.

3. FASE PREANALÍTICA Y SELECCIÓN DE LA MUESTRA

La fase preanalítica abarca desde la indicación y obtención de la muestra hasta que el ácido nucleico está disponible para el ensayo. Incluye isquemia, fijación, descalcificación, procesamiento, almacenamiento, selección del bloque, revisión histológica, macro o microdisección y trazabilidad. Sus efectos son analito-dependientes: una condición aceptable para morfología puede no ser óptima para ARN, fragmentos largos de ADN o determinadas modificaciones epigenéticas.

Las normas ISO 20166-1:2018 e ISO 20166-3:2018 especifican condiciones preanalíticas para ARN y ADN aislados de tejido fijado en formalina e incluido en parafina. Ambas fueron confirmadas como vigentes por ISO en 2024. Su mensaje práctico es que tiempo de isquemia, fijador, duración de fijación, procesamiento, conservación y extracción deben estar definidos y documentados. No basta con que un bloque «tenga buen aspecto» en H-E.

3.1. Tipos de muestra

Puede analizarse tejido fresco, congelado, fijado e incluido en parafina, citologías, sangre, médula ósea, fluidos, plasma o ADN circulante, entre otros. El tejido congelado suele preservar mejor ácidos nucleicos, pero exige un circuito prospectivo y correlación morfológica. El bloque de parafina es la fuente más habitual en Patología Molecular porque integra diagnóstico, archivo y disponibilidad; su limitación es el daño inducido por fijación y procesamiento.

Las citologías pueden ser excelentes muestras si se valida el tipo de preparación y se conserva material diagnóstico. Un extendido, un bloque celular o una suspensión no son intercambiables sin evaluación. En biopsias pequeñas debe equilibrarse la necesidad de IHQ, técnicas in situ y análisis molecular. Agotar el bloque en una batería indiscriminada puede impedir el biomarcador que realmente decide tratamiento.

3.2. Fijación en formalina y artefactos

La formalina entrecruza proteínas y modifica ácidos nucleicos. Con el tiempo favorece fragmentación, enlaces cruzados y modificaciones de bases. La desaminación de citosina puede generar uracilo y, durante amplificación, artefactos aparentes C>T/G>A, a menudo de baja frecuencia. Do y colaboradores demostraron en 2013 que el tratamiento con uracil-ADN glicosilasa puede reducir este tipo de artefactos en ADN FFPE (PMID 22643842). La medida no corrige toda lesión del ADN y debe formar parte de un ensayo validado.

En 2018, libre, pregunta 17, la respuesta oficial B vinculó una formalina tamponada en torno a pH 6,8-7,2 con evitar daño del ADN y pigmento de formalina. El mensaje durable es utilizar formalina neutra tamponada y un procedimiento controlado. El intervalo de aquella pregunta no debe convertirse en un criterio molecular aislado: concentración, volumen, tiempo, temperatura y retraso hasta fijación también importan.

3.3. Descalcificación

Los descalcificantes ácidos intensos pueden degradar ADN y ARN y comprometer hibridación o amplificación. EDTA y algunos protocolos con ácidos más suaves preservan mejor determinados analitos, aunque requieren más tiempo y validación por tipo de muestra. En una metástasis ósea potencialmente candidata a biomarcadores, la decisión del descalcificante puede determinar si el análisis molecular es posible. El laboratorio debe registrar qué método se utilizó y conocer qué ensayos admite.

3.4. Selección histológica y enriquecimiento tumoral

El patólogo revisa una sección representativa, marca la región de interés y estima celularidad neoplásica. Esta estimación no equivale automáticamente a fracción alélica: intervienen heterocigosidad, ploidía, número de copias, subclonalidad y contaminación por células no tumorales. Aun así, es esencial para comparar la fracción esperable con el límite de detección del método.

La macrodisección elimina áreas no deseadas raspando o recortando una región marcada; la microdisección permite una selección más fina. Deben evitarse necrosis extensa, mucina acelular, inflamación dominante y tejido normal cuando diluyan la señal. También hay que conservar heterogeneidad relevante: seleccionar solo un foco mínimo puede perder subclones presentes en otra zona.

3.5. Contaminación y trazabilidad

La contaminación puede ser cruzada entre bloques, durante el corte, en la extracción o por productos amplificados. Deben existir limpieza de micrótomo, cambio de cuchilla o zonas de cuchilla según procedimiento, controles en blanco cuando estén indicados, identificación inequívoca y separación física o temporal de áreas pre y posamplificación. Una variante inesperada exige revisar identidad, mezcla, contaminación y contexto antes de concluir que representa biología tumoral.

La trazabilidad conecta solicitud, muestra primaria, bloque, corte, tubo, extracto, biblioteca, corrida, archivo de datos e informe. Los identificadores deben evitar transcripción manual innecesaria. Si se repite extracción o análisis, debe conservarse el vínculo entre réplicas y documentarse qué resultado se liberó y por qué.

4. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Extraer significa liberar el ácido nucleico de células y matriz; purificar significa separarlo de proteínas, lípidos, sales, parafina, pigmentos, inhibidores y otras moléculas. Un procedimiento de extracción comprende lisis, inactivación o separación de nucleasas, eliminación de contaminantes, recuperación del analito y elución o resuspensión. Su elección depende de ADN o ARN, tipo de muestra, cantidad, fragmentación tolerada, rendimiento requerido, automatización y método posterior.

4.1. Preparación del tejido FFPE

En material parafinado se seleccionan cortes o cilindros de la región marcada. La parafina se elimina mediante un reactivo compatible con el protocolo o procesos integrados de desparafinado. La digestión proteolítica, habitualmente con proteinasa K, libera el material; el calor y las condiciones químicas pueden ayudar a revertir parcialmente enlaces cruzados. El exceso de tejido no siempre aumenta el rendimiento útil: puede saturar la matriz de purificación y arrastrar inhibidores.

La superficie de corte y el grosor total procesado deben estar definidos. En fragmentos pequeños hay que evitar perder el tejido durante transferencias. En muestras pigmentadas, necróticas o con abundante mucina pueden necesitarse ajustes validados. No es seguro improvisar reactivos porque el eluido final debe ser compatible con polimerasas, ligasas y sistemas de secuenciación.

4.2. Extracción orgánica

Los métodos clásicos con fenol-cloroformo separan proteínas y lípidos en una fase orgánica y conservan ácidos nucleicos en la fase acuosa; después se precipitan con alcohol y sales. Pueden producir ADN de alto peso molecular en material adecuado, pero utilizan reactivos peligrosos, requieren manipulación, favorecen variabilidad y pueden dejar fenol residual inhibidor. Conservan valor histórico, de investigación o para aplicaciones concretas, pero no son la única referencia en diagnóstico.

4.3. Precipitación salina

El salting out precipita proteínas mediante concentraciones elevadas de sal y recupera el ácido nucleico por precipitación alcohólica. Evita disolventes orgánicos, aunque exige controlar residuos de sal. Como en cualquier método, alto rendimiento aparente no compensa inhibición o pérdida de integridad.

4.4. Membranas de sílice

En presencia de sales caotrópicas, los ácidos nucleicos se unen a sílice. Tras lavados, se eluyen en condiciones de baja fuerza iónica. Las columnas de centrifugación y muchos sistemas automatizados usan este principio. Son reproducibles y compatibles con flujo diagnóstico, pero tienen límites de carga y perfiles de recuperación de fragmentos. Una columna diseñada para ADN genómico no debe asumirse equivalente a otra para ARN pequeño o ADN circulante.

4.5. Partículas magnéticas

Las perlas paramagnéticas recubiertas permiten capturar ácidos nucleicos y separarlos mediante un campo magnético. Facilitan automatización, reducción de transferencias y escalado. Al modificar proporción de perlas y condiciones puede seleccionarse un rango de tamaños, principio también utilizado para limpiar productos y bibliotecas. La selección no es absoluta; debe validarse para evitar pérdida sesgada de fragmentos clínicamente relevantes.

4.6. Extracción de ARN

La extracción de ARN exige inactivar RNasas y minimizar tiempo de exposición. Los agentes caotrópicos desnaturalizan proteínas y ayudan a proteger el analito. Si se pretende estudiar ARN, puede incluirse una digestión con DNasa para retirar ADN genómico; después debe comprobarse que la nucleasa se eliminó o inactivó. Para análisis de expresión, un control sin transcriptasa inversa permite detectar señal procedente de ADN contaminante.

El ARN total incluye ARN ribosómico, mensajero y otras especies. Según la aplicación puede enriquecerse ARNm mediante colas poli(A), reducir ARN ribosómico o capturar transcritos diana. En FFPE, el ARN fragmentado y modificado favorece diseños con amplicones cortos o bibliotecas adaptadas. La calidad que necesita una qPCR dirigida no es necesariamente la misma que exige una secuenciación de transcriptoma.

4.7. Coextracción y almacenamiento

Algunos protocolos recuperan ADN y ARN de la misma región, útil cuando el tejido es escaso y se necesitan alteraciones genómicas y fusiones expresadas. Debe conocerse si la coextracción sacrifica rendimiento o calidad de uno de los analitos. El almacenamiento posterior debe minimizar ciclos de congelación-descongelación, evaporación, contaminación y degradación. Temperatura, recipiente, concentración y duración se fijan en el procedimiento validado.

5. CANTIDAD, PUREZA, INTEGRIDAD Y AMPLIFICABILIDAD

La evaluación de un extracto responde a preguntas diferentes: cuánto ácido nucleico hay, qué contaminantes contiene, qué longitud conservan sus fragmentos y si puede actuar como molde. Ninguna medida aislada responde a todo. El laboratorio debe definir controles de aceptación para cada combinación de muestra y ensayo, basados en validación y no en cifras heredadas sin contexto.

5.1. Espectrofotometría

Los ácidos nucleicos absorben luz ultravioleta alrededor de 260 nm. La absorbancia permite estimar concentración, pero otras moléculas que absorben en esa región pueden sobreestimarla. Los cocientes A260/A280 y A260/A230 aportan indicios de contaminación. Como orientación convencional, un ADN relativamente puro presenta A260/A280 próximo a 1,8 y un ARN próximo a 2,0; un A260/A230 alrededor de 1,8-2,0 se considera habitualmente favorable. Son valores aproximados descritos por documentación técnica, no umbrales universales de aptitud.

Un cociente bajo puede sugerir proteína, fenol u otros contaminantes; un cociente alto puede reflejar baja concentración, ruido, blanco inadecuado o composición del analito. En concentraciones pequeñas, los cocientes se vuelven inestables. Además, una muestra muy degradada puede mostrar un cociente «bonito». Por ello la espectrofotometría no acredita por sí sola integridad ni cantidad específica de ADN bicatenario.

5.2. Fluorometría

Los ensayos fluorométricos utilizan colorantes con afinidad selectiva por ADN bicatenario, ADN monocatenario o ARN. Suelen ser más específicos y sensibles en concentraciones bajas que la absorbancia. Requieren una curva o estándares, un rango válido y condiciones reproducibles. Si el ensayo de biblioteca necesita ADN bicatenario, una fluorometría específica es más informativa que la absorbancia total.

La comparación entre concentración espectrofotométrica y fluorométrica puede revelar contaminación o gran proporción de material no diana. No debe buscarse que ambos métodos den exactamente la misma cifra: miden propiedades distintas. La discrepancia debe interpretarse y, si supera lo esperado por el procedimiento, investigarse.

5.3. Integridad y tamaño

La electroforesis convencional o microfluídica muestra distribución de tamaños. Para ARN fresco puede calcularse un índice de integridad basado en perfiles ribosómicos. En FFPE, donde la fragmentación es intrínseca, resulta más útil valorar la proporción de fragmentos por encima de una longitud de referencia, como DV200, o emplear un ensayo funcional. DV200 significa porcentaje de fragmentos de ARN mayores de 200 nucleótidos; los umbrales concretos dependen de plataforma y protocolo.

Para ADN FFPE pueden usarse electroforesis, sistemas microfluídicos o qPCR con amplicones de diferente longitud. Un ADN aparentemente abundante puede no amplificar un fragmento largo. Los ensayos dirigidos a amplicones cortos suelen tolerar mejor degradación, aunque una diana demasiado corta aumenta otros retos de especificidad y diseño.

5.4. Amplificabilidad e inhibición

Una PCR de control o un ensayo de calidad por qPCR mide funcionalmente si el extracto permite amplificación. Comparar diluciones puede revelar inhibición: si al diluir mejora de forma desproporcionada el comportamiento, se reduce un inhibidor además del molde. Los controles internos añadidos antes o después de extracción ayudan a localizar fallos, pero deben diseñarse para no competir excesivamente con la diana.

En ARN, la amplificabilidad depende de transcripción inversa y de integridad alrededor de la región diana. Un gen de referencia debe expresarse de manera suficientemente estable en el material estudiado; no es universal. Para fusiones, un control de ARN endógeno demuestra que la muestra contiene transcritos analizables, pero no garantiza que una fusión no expresada o fuera del diseño esté ausente.

6. ELECTROFORESIS Y TÉCNICAS DE BLOTTING

6.1. Fundamento de la electroforesis

La electroforesis separa moléculas cargadas al aplicar un campo eléctrico. Los ácidos nucleicos poseen carga neta negativa por sus grupos fosfato y migran hacia el electrodo positivo o ánodo. En una matriz porosa, los fragmentos pequeños encuentran menos resistencia y avanzan más que los grandes. La movilidad también depende de conformación, composición del gel, concentración de tampón, voltaje, temperatura y presencia de colorantes.

El gel funciona simultáneamente como soporte y tamiz molecular. Las muestras se cargan en pocillos junto con un tampón de carga que aporta densidad y marcadores de migración. Un patrón de tamaño conocido permite estimar longitud de los productos. Después se visualizan con colorantes intercalantes o fluorescentes. La intensidad de una banda ofrece una aproximación semicuantitativa solo dentro del rango del sistema; no debe confundirse con una medida exacta de copias.

6.2. Gel de agarosa

La agarosa es el soporte habitual para separar fragmentos de ADN en un rango amplio. Se vierte normalmente en una cubeta horizontal. Aumentar la concentración de agarosa reduce el tamaño medio de poro y mejora la resolución de fragmentos pequeños; reducirla favorece la migración de fragmentos mayores. La elección debe ajustarse al producto esperado y a la diferencia que se quiere discriminar.

En PCR a tiempo final, el producto amplificado se separa en agarosa y se interpreta por presencia, ausencia y tamaño de banda en relación con controles. Este punto fue preguntado en 2018, libre, pregunta 26: la respuesta oficial C identificó el gel de agarosa como electroforesis que se realiza en horizontal. La lectura debe incluir siempre control positivo, control negativo y marcador de tamaño; una banda del tamaño aparente correcto no demuestra por sí sola identidad de secuencia.

6.3. Poliacrilamida y electroforesis capilar

La poliacrilamida forma una matriz de poro más pequeño y regulable, con alta resolución para fragmentos que difieren poco en tamaño. Los geles suelen disponerse verticalmente y pueden utilizarse en condiciones nativas o desnaturalizantes. La acrilamida monomérica requiere precauciones de seguridad. Su elevada resolución sustentó técnicas clásicas de secuenciación y análisis de fragmentos.

La electroforesis capilar desplaza fragmentos por capilares rellenos de polímero y detecta fluoróforos al atravesar una ventana óptica. Es la base de la secuenciación de Sanger automatizada y del análisis de fragmentos para microsatélites, MLPA o productos marcados. El software representa tamaño e intensidad como picos. La asignación precisa exige un estándar interno, calibración y reconocimiento de artefactos como stutter, picos de colorante o señal saturada.

6.4. Electroforesis de campo pulsado y microfluídica

Los fragmentos de ADN muy grandes se separan mal con un campo constante. La electroforesis de campo pulsado cambia periódicamente la dirección del campo, obligando a las moléculas a reorientarse y permitiendo resolver tamaños mayores. Ha sido relevante en epidemiología molecular y análisis de ADN de gran tamaño, aunque muchas aplicaciones han migrado a secuenciación.

Los sistemas microfluídicos miniaturizan la separación, requieren poco volumen y generan electroferogramas, imágenes virtuales de gel y métricas de tamaño o integridad. Son útiles para comprobar ARN, ADN y bibliotecas. Sus resultados dependen del kit y del rango de tamaño; una muestra fuera de rango puede producir una métrica engañosa.

6.5. Southern, Northern y Western blot

El término blotting describe la transferencia de moléculas separadas en un gel hacia una membrana donde pueden detectarse. En Southern blot, el ADN se fragmenta —clásicamente con enzimas de restricción—, se separa, se desnaturaliza y se transfiere a una membrana. Una sonda marcada complementaria reconoce la secuencia diana. La combinación de tamaño y señal permitió estudiar reordenamientos, integraciones y número de copias antes de la generalización de PCR y NGS.

El Northern blot aplica una lógica similar al ARN y permite observar tamaño y abundancia relativa del transcrito. El Western blot, pese al nombre paralelo, estudia proteínas: separación electroforética, transferencia e inmunodetección. No es una técnica de ácidos nucleicos. Existen otras variantes, como dot blot sin separación previa o Southwestern para interacciones proteína-ADN, pero las tres denominaciones principales deben dominarse.

El blotting ilustra un principio aún vigente: separar, transferir, inmovilizar y detectar. Muchas aplicaciones diagnósticas han sido sustituidas por métodos más rápidos y sensibles, pero conocerlo permite comprender hibridación, sondas, transferencia y la diferencia entre detección de diana y amplificación. La elección histórica de una técnica no implica que siga siendo el método de primera línea para cada biomarcador.

7. NUCLEASAS, CLONACIÓN Y VECTORES

7.1. Clasificación funcional de las nucleasas

Las nucleasas hidrolizan enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos. Una endonucleasa corta dentro de una cadena; una exonucleasa elimina nucleótidos desde un extremo. Según el sustrato, se habla de DNasas y RNasas; algunas prefieren moléculas mono o bicatenarias y otras reconocen estructuras concretas. Estas categorías se superponen: una enzima puede poseer varias actividades y su comportamiento depende de cofactores y condiciones.

Las DNasas se utilizan para retirar ADN contaminante de preparaciones de ARN o degradar ADN libre. Las RNasas permiten eliminar ARN o estudiar protección de transcritos. El laboratorio debe evitar nucleasas ambientales durante extracción, pero después puede emplearlas de forma controlada como herramientas. La diferencia es la trazabilidad: una RNasa contaminante destruye el analito; una RNasa añadida en una etapa validada elimina lo que no interesa.

7.2. Endonucleasas de restricción

Las enzimas de restricción bacterianas reconocen secuencias específicas y cortan ADN. Las de tipo II, esenciales en biología molecular clásica, cortan dentro o cerca de su sitio de reconocimiento y generan extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos complementarios favorecen la unión dirigida; los romos pueden ligarse sin complementariedad saliente, habitualmente con menor eficiencia y sin orientación intrínseca.

La digestión depende de tampón, temperatura, metilación de la diana, cantidad de enzima y pureza del ADN. Condiciones no óptimas pueden causar actividad inespecífica. Un mapa de restricción predice tamaños de fragmentos y permite comprobar una construcción por electroforesis. Aunque la clonación moderna incluye ensamblajes sin restricción clásica, el concepto sigue siendo básico para comprender manipulación de ADN.

7.3. Otras enzimas de manipulación

Las ligasas unen extremos mediante enlaces fosfodiéster. Las polimerasas sintetizan ADN y pueden poseer actividad correctora o exonucleasa. Las fosfatasas retiran fosfatos y reducen religación de un vector; las quinasas los añaden. La transcriptasa inversa genera ADN complementario a partir de ARN. Las nucleasas programables, como los sistemas CRISPR asociados a Cas, reconocen secuencias mediante ARN guía y permiten cortar o modificar regiones dirigidas, con aplicaciones de investigación, diagnóstico y terapia.

La uracil-ADN glicosilasa no es una nucleasa clásica de corte del esqueleto: elimina uracilo y deja un sitio abásico que después puede procesarse. Esta precisión es útil porque se emplea tanto para reducir artefactos FFPE como en sistemas de prevención de contaminación PCR con dUTP/UNG. En cada caso, el momento de incubación y la compatibilidad con el ensayo son distintos.

7.4. Clonación molecular

Clonar una secuencia significa generar copias a partir de una molécula insertada en un vehículo replicativo. En el esquema clásico se prepara el inserto y el vector, se generan extremos compatibles, se ligan, se introduce la construcción en una célula hospedadora y se seleccionan las células transformadas. Cada colonia deriva idealmente de una célula y contiene una población clonal de la construcción.

Después se verifica orientación, tamaño y secuencia mediante digestión, PCR y secuenciación. La selección no equivale a confirmación: una colonia resistente puede contener vector vacío, inserto incorrecto o reordenado. En expresión recombinante, además deben comprobarse marco de lectura, promotor, etiqueta y producto proteico.

7.5. Vectores

Un vector debe poseer un origen de replicación, un marcador seleccionable y una región donde insertar ADN. Los plásmidos son moléculas circulares extracromosómicas y constituyen los vectores clásicos para insertos de tamaño manejable. Bacteriófagos, cosmídicos, cromosomas artificiales bacterianos y cromosomas artificiales de levadura permiten estrategias e insertos diferentes. «Vector» también se utiliza para vehículos de expresión o transferencia génica; debe precisarse el contexto.

Un vector de expresión incorpora elementos que controlan transcripción y, si procede, traducción: promotor, señales reguladoras, sitio de unión ribosomal o secuencia Kozak, terminación y etiquetas. El mismo inserto puede comportarse de manera distinta en bacterias, levaduras o células de mamífero. La elección del sistema depende de plegamiento, modificaciones postraduccionales, toxicidad y finalidad.

8. PCR CONVENCIONAL: FUNDAMENTO, DISEÑO Y CONTROL

8.1. Componentes

La reacción en cadena de la polimerasa amplifica una región delimitada por dos cebadores. Requiere ADN molde, cebador directo y reverso, desoxirribonucleótidos, una ADN polimerasa termoestable, tampón, magnesio y condiciones térmicas apropiadas. La Taq polimerasa, procedente de Thermus aquaticus, hizo posible automatizar ciclos repetidos sin reponer enzima. El SAS la identificó en 2022, extraordinaria, pregunta 66, respuesta oficial C.

Los cebadores se orientan hacia la región que se desea copiar y sus extremos 3′ delimitan el amplicón. Deben ser específicos, de temperaturas de fusión compatibles y sin complementariedad que favorezca dímeros. El magnesio afecta actividad enzimática, hibridación y fidelidad. Una concentración excesiva puede aumentar productos inespecíficos; una insuficiente reduce rendimiento. La optimización es un equilibrio, no una búsqueda ciega de máxima señal.

8.2. Ciclo térmico

Cada ciclo incluye desnaturalización para separar cadenas, alineamiento para que los cebadores hibriden y extensión para que la polimerasa sintetice. Una desnaturalización inicial prepara el molde y una extensión final puede completar productos. En condiciones ideales, el número de moléculas crece exponencialmente al comienzo, pero con el tiempo reactivos, reannealing de productos e inhibición conducen a una meseta.

La PCR convencional se analiza al final. La banda de tamaño esperado sugiere amplificación, pero puede corresponder a un producto inespecífico de tamaño similar. La identidad puede comprobarse por sonda, digestión o secuenciación. La ausencia de banda solo es interpretable si el control de extracción y amplificación demuestra que la muestra era competente.

8.3. Fases de la amplificación

Puede distinguirse una fase basal, una fase exponencial, una fase aproximadamente lineal y una meseta. La cuantificación fiable se realiza durante la fase exponencial, antes de que la disponibilidad de reactivos limite la reacción. Por eso medir intensidad de una banda final es peor para cuantificar que observar en tiempo real el punto en que la fluorescencia emerge del fondo.

8.4. Especificidad y diseño

El diseño debe considerar secuencias repetitivas, pseudogenes, polimorfismos bajo cebadores, contenido GC, estructura secundaria y longitud del amplicón. En FFPE suelen preferirse amplicones cortos. Para ARN, colocar cebadores o sondas sobre una unión exón-exón puede favorecer especificidad por ADNc, aunque no siempre es posible y debe comprobarse cada transcrito.

Una PCR alelo-específica coloca la base discriminante cerca del extremo 3′ de un cebador y amplifica preferentemente una variante. Ofrece rapidez y sensibilidad para dianas conocidas, pero no detecta alteraciones fuera del diseño. La PCR multiplex combina varios pares de cebadores; ahorra material, pero aumenta interacciones y exige demostrar rendimiento equilibrado de cada diana.

8.5. Controles

El control sin molde contiene reactivos pero no ADN de muestra y vigila contaminación de mezcla o ambiente. El control positivo verifica capacidad de detectar la diana, pero debe manejarse de forma que no se convierta en fuente de contaminación. Un control negativo conocido ayuda a evaluar especificidad. El blanco de extracción atraviesa el proceso y detecta contaminación introducida antes de la PCR. Un control interno de amplificación informa de inhibición o fallo, siempre que su diseño y concentración sean adecuados.

Para ensayos de ARN se añade el control sin transcriptasa inversa, que ayuda a identificar ADN genómico residual. Los controles no son intercambiables: un control positivo que amplifica no demuestra que la extracción de la muestra funcionó; un control sin molde limpio no excluye mezcla entre dos muestras.

8.6. Prevención de contaminación

Los productos PCR son concentrados y contaminan con facilidad reacciones posteriores. El flujo debe ser unidireccional: preparación de reactivos, adición de muestra, amplificación y análisis pos-PCR en áreas separadas o con barreras equivalentes. Se emplean material dedicado, puntas con filtro, limpieza y controles. Los sistemas dUTP/UNG permiten sustituir timina por uracilo en productos previos y degradarlos antes de una nueva amplificación, sin eliminar ADN genómico natural.

8.7. Ventajas y límites

La PCR es rápida, sensible, escalable y compatible con poco material. Sus principales riesgos son contaminación, amplificación preferencial, caída alélica, inhibición y ceguera frente a alteraciones no incluidas. Una deleción o variante bajo un sitio de cebador puede impedir amplificar un alelo y simular homocigosis o ausencia. Para interpretar un negativo hay que conocer regiones cubiertas, tipos de variante detectables y límite de detección.

9. RT-PCR, qPCR, PCR DIGITAL Y VARIANTES

9.1. Ambigüedad de la sigla RT-PCR

RT-PCR debe significar aquí PCR con transcriptasa inversa, porque así lo especifica el temario. En otros textos, «RT» se utiliza de manera ambigua para real time; conviene escribir RT-qPCR cuando se combina transcripción inversa y cuantificación en tiempo real. Esta nomenclatura evita confundir analito de partida con modo de detección.

La transcriptasa inversa sintetiza ADN complementario —ADNc— a partir de ARN. La reacción puede cebarse con oligo(dT), cebadores aleatorios o específicos. Oligo(dT) favorece ARN poliadenilado y depende de conservar la región 3′; los aleatorios cubren más especies; los específicos maximizan una diana pero limitan reutilización. Después, el ADNc se amplifica por PCR.

En 2022, extraordinaria, pregunta 40, el SAS preguntó qué ácido nucleico se utiliza como punto de partida en una RT-PCR. La respuesta oficial fue B, ARN. El producto intermedio es ADNc y la amplificación posterior es de ADN, pero el analito original que justifica la transcripción inversa es ARN.

9.2. PCR cuantitativa en tiempo real

La qPCR registra fluorescencia en cada ciclo. Puede utilizar un colorante que se une a ADN bicatenario o una sonda específica que genera señal al producirse amplificación. Los colorantes son versátiles y económicos, pero detectan también productos inespecíficos y dímeros; las sondas añaden especificidad y permiten multiplexar según fluoróforos y plataforma.

El ciclo de cuantificación —Cq— es el ciclo en que la señal cruza un criterio definido en la región informativa. Cuanto mayor era la cantidad inicial de diana, antes aparece señal y menor suele ser el Cq. No existe un Cq universal que separe positivo y negativo: depende de ensayo, umbral, eficiencia, fondo, muestra y finalidad. Las directrices MIQE 2.0 de 2025 recomiendan transparencia sobre diseño, controles, eficiencia, normalización, análisis y datos para que la qPCR sea evaluable y reproducible (PMID 40272429).

9.3. Química con colorante y curva de fusión

Con un colorante intercalante, tras la amplificación puede aumentarse gradualmente la temperatura y registrar la pérdida de fluorescencia al desnaturalizarse el producto. La derivada genera una curva de fusión con uno o varios picos. Un pico principal compatible con el producto esperado apoya especificidad; picos adicionales sugieren productos distintos o dímeros. Sin embargo, dos secuencias diferentes pueden fundir de forma similar y una sola curva no confirma secuencia.

Esta curva ordinaria de qPCR no debe confundirse con el análisis de metilación por fusión de alta resolución. En metilación se necesita un diseño que transforme diferencias epigenéticas en diferencias de secuencia o comportamiento térmico, habitualmente tras bisulfito. La mera presencia de un pico de fusión no mide metilación.

9.4. Cuantificación absoluta y relativa

La cuantificación absoluta compara con una curva de estándares de concentración conocida. La relativa compara la diana con uno o más genes de referencia y con una muestra calibradora. El método de Cq relativo exige eficiencias apropiadas y estables; usar una fórmula sin comprobarlas produce resultados sesgados. Los genes de referencia deben validarse en el tejido y condición, porque su expresión puede cambiar con necrosis, proliferación o tratamiento.

Una curva estándar permite estimar eficiencia a partir de la pendiente y verificar linealidad y rango. Los estándares deben ser trazables y comportarse de forma semejante a la muestra. Una construcción plasmídica limpia puede amplificar mejor que ADN FFPE y no modelar inhibición ni fragmentación; por eso la calibración debe ajustarse a la finalidad.

9.5. PCR digital

La PCR digital divide la reacción en muchas particiones. Tras amplificar, cada partición se clasifica como positiva o negativa y se estima la concentración mediante un modelo, habitualmente Poisson, que corrige particiones con más de una molécula. Puede implementarse en gotas o cámaras. La cuantificación no depende de una curva estándar del mismo modo que qPCR, aunque sí de volumen de partición, clasificación de señal, controles y supuestos del método.

La dPCR es útil para variantes de baja frecuencia, número de copias, enfermedad mínima, monitorización o cuantificación precisa de dianas conocidas. No es «infalible»: lluvia entre poblaciones, inhibición, volumen muerto, fragmentación, enlace físico entre dianas y errores de clasificación afectan el resultado. Las recomendaciones dMIQE actualizadas en 2020 exigen informar particionado, controles, umbrales, incertidumbre y análisis (PMID 32746458).

9.6. PCR anidada, multiplex, alelo-específica y larga

La PCR anidada realiza una segunda amplificación con cebadores internos y aumenta especificidad y sensibilidad, pero abrir tubos tras la primera ronda eleva riesgo de contaminación. La hemi-nested reutiliza uno de los cebadores. La multiplex amplifica varias dianas en un tubo y exige balance. La alelo-específica discrimina secuencias conocidas. La PCR de largo alcance emplea polimerasas y condiciones que permiten amplicones mayores, poco compatible con ADN FFPE muy fragmentado.

10. OTRAS AMPLIFICACIONES DE DIANA, SONDA Y SEÑAL

«Amplificación» puede significar tres fenómenos distintos. En la amplificación de diana se generan copias del ácido nucleico buscado. En la amplificación de sonda se amplifican moléculas sonda unidas correctamente, no la diana original. En la amplificación de señal se construye una señal detectable sobre cada evento de hibridación sin multiplicar la diana. Esta clasificación permite entender métodos que no siguen los ciclos térmicos clásicos.

10.1. Amplificación isotérmica de diana

LAMP —amplificación isotérmica mediada por bucle— utiliza varios cebadores que reconocen múltiples regiones y una polimerasa con desplazamiento de cadena. Opera a temperatura aproximadamente constante y genera estructuras de bucle y gran cantidad de producto. Fue descrita por Notomi y colaboradores en 2000 (PMID 10871386). Es rápida y adaptable a detección sencilla, pero el diseño es complejo y la enorme producción aumenta riesgo de contaminación si se abre la reacción.

NASBA es una amplificación isotérmica orientada a ARN que combina transcriptasa inversa, RNasa H y ARN polimerasa dependiente de ADN. Compton la describió en 1991 (PMID 1706072). La amplificación mediada por transcripción y otras estrategias relacionadas también explotan producción reiterada de ARN. La ausencia de termociclado facilita ciertos formatos, pero no elimina necesidad de controles ni especificidad.

La amplificación por desplazamiento múltiple utiliza cebadores y una polimerasa con fuerte desplazamiento de cadena para amplificar genoma, incluso a partir de poca cantidad. Puede introducir sesgo de representación, quimeras y errores. En célula única o material limitado, el perfil de una amplificación genómica previa debe incorporarse a la validación y a la interpretación.

10.2. Amplificación de sonda: MLPA

En MLPA —amplificación de sondas dependiente de ligación múltiple—, dos semisondas hibridan adyacentes sobre la diana. Solo si ambas se unen correctamente pueden ligarse; después se amplifica la sonda ligada mediante cebadores universales. Cada par genera un producto de longitud característica y la electroforesis capilar compara su señal relativa. Schouten y colaboradores presentaron el método en 2002 (PMID 12060695).

MLPA permite estudiar deleciones y duplicaciones de múltiples exones con poco ADN. Algunas variantes incorporan sondas sensibles a metilación. Sus límites incluyen variantes bajo las zonas de unión, calidad del ADN, normalización y mosaicos por debajo del rendimiento validado. Una señal reducida puede deberse a deleción o a fallo de hibridación/ligación por una variante puntual; debe confirmarse por un método apropiado.

10.3. Amplificación de señal

En los sistemas de ADN ramificado, la diana se captura y sucesivas sondas crean una estructura con muchos marcadores. En Hybrid Capture, híbridos ARN-ADN se reconocen con anticuerpos y una cadena de reactivos aumenta señal; ha sido ampliamente utilizado en detección de VPH. La diana no se copia, lo que reduce contaminación por amplicones, aunque no elimina reactividad cruzada ni limitaciones de umbral.

La amplificación con tiramida deposita múltiples moléculas marcadas cerca de una enzima unida al evento de reconocimiento. Se utiliza para intensificar hibridación in situ o inmunomarcaje. La señal ampliada mejora detección, pero también puede aumentar fondo y ensanchar localización aparente. «Más señal» no equivale automáticamente a «más especificidad».

10.4. Hibridación in situ amplificada

Las técnicas in situ preservan contexto celular. Sistemas con sondas múltiples y árboles de preamplificadores/amplificadores permiten visualizar moléculas individuales de ARN como puntos. En Anatomía Patológica pueden demostrar transcritos, virus o fusiones manteniendo la morfología. La interpretación exige controles tisulares, evaluación de fondo, calidad del ARN y criterios validados por tipo de muestra.

11. METILACIÓN Y ANÁLISIS DE CURVAS

11.1. Fundamento biológico

La metilación del ADN humano afecta principalmente al carbono 5 de citosinas en dinucleótidos CpG, generando 5-metilcitosina. Los CpG se distribuyen de forma desigual y existen regiones ricas en ellos, frecuentemente llamadas islas CpG. La metilación de regiones promotoras puede asociarse a cromatina represiva y menor transcripción, mientras que la metilación en cuerpos génicos o elementos repetitivos tiene significados diferentes. No debe enseñarse «metilación = apagado» sin especificar locus y contexto.

En cáncer coexisten hipometilación global relativa e hipermetilación focal de determinados promotores. Estos cambios pueden contribuir a inestabilidad, expresión aberrante y silenciamiento de supresores. Algunos patrones de metilación sirven como biomarcadores diagnósticos, clasificadores moleculares o predictores, pero su utilidad es específica de entidad, método y guía vigente. Un ensayo no debe transferirse de un tumor a otro solo porque estudie el mismo gen.

11.2. Conversión con bisulfito

El bisulfito convierte citosinas no metiladas en uracilo mediante una secuencia de reacciones; después de PCR se leen como timina. La 5-metilcitosina permanece mayoritariamente como citosina. Así, una diferencia epigenética se transforma en una diferencia de secuencia que puede interrogarse mediante cebadores, sondas, fusión o secuenciación. Herman y colaboradores establecieron en 1996 la PCR específica de metilación basada en este principio (PMID 8790415).

La conversión es agresiva y fragmenta ADN. Una conversión incompleta produce falsas citosinas «metiladas»; una conversión excesiva reduce recuperación. Deben incluirse controles metilado, no metilado y de conversión, además de controlar cantidad e integridad. El bisulfito convencional no distingue de forma directa 5-metilcitosina de 5-hidroximetilcitosina, limitación relevante en determinados contextos biológicos.

11.3. PCR específica de metilación y qMSP

La MSP utiliza pares de cebadores que discriminan la secuencia convertida correspondiente a alelos metilados o no metilados. Es sensible y requiere poco material, pero su carácter cualitativo, sesgo de cebadores y contaminación pueden complicar la lectura. La qMSP o MethyLight añade detección en tiempo real y permite cuantificación relativa, siempre que se definan normalizadores, calibradores y criterios validados.

Una muestra tumoral contiene mezclas de células y alelos. Detectar señal metilada no significa que todas las moléculas estén metiladas; no detectarla puede reflejar baja proporción tumoral, degradación o regiones CpG no cubiertas. El informe debe indicar locus, región, método, resultado y limitación, evitando convertir una señal relativa en porcentaje celular sin modelo que lo sustente.

11.4. Análisis de fusión de alta resolución sensible a metilación

La expresión del temario «análisis de la curva de metilación» se entiende técnicamente mediante el methylation-sensitive high-resolution melting o MS-HRM. Después de conversión con bisulfito y PCR, los productos derivados de ADN metilado conservan más citosinas y difieren en composición, temperatura y forma de fusión respecto a productos no metilados. Wojdacz y Dobrovic describieron el método en 2007 (PMID 17289753).

En HRM se registra fluorescencia con incrementos térmicos pequeños y se normalizan curvas para comparar perfiles. Estándares con proporciones conocidas ayudan a interpretar desplazamientos y formas. Una muestra heterogénea puede producir curvas complejas por heterodúplex; no siempre se asigna a un porcentaje exacto. Temperatura, concentración de sales, longitud, distribución de CpG, colorante, plataforma y análisis influyen en el perfil.

La diferencia con una curva de fusión qPCR ordinaria es fundamental. La curva ordinaria se utiliza sobre todo para comprobar productos; MS-HRM se diseña específicamente para convertir metilación en diferencias de secuencia y fusión. Si no hubo bisulfito o una estrategia equivalente, la curva no «ve» directamente grupos metilo.

11.5. Secuenciación y otras estrategias de metilación

La secuenciación tras bisulfito permite observar citosinas convertidas a nivel de posición. La pirosecuenciación cuantifica incorporación en regiones cortas; Sanger muestra mezclas con menor capacidad cuantitativa; NGS permite múltiples loci o perfiles amplios. Otras técnicas usan enzimas sensibles a metilación, enriquecimiento de ADN metilado o lecturas directas en plataformas de molécula única.

Los arrays de metilación interrogan cientos de miles de sitios predefinidos y pueden generar clasificadores tumorales. Exigen normalización, control de calidad, cohortes de referencia y algoritmos versionados. Una puntuación clasificadora no reemplaza la histología; debe integrarse con calidad de muestra y proximidad a clases de referencia. El resultado puede ser no clasificable si la señal es pobre o la entidad no está representada.

12. SECUENCIACIÓN DE SANGER

12.1. Principio de terminación de cadena

La secuenciación de Sanger determina el orden de bases mediante síntesis y terminación. La mezcla contiene una plantilla, un cebador, ADN polimerasa, desoxinucleótidos y una proporción de didesoxinucleótidos fluorescentes. Los ddNTP carecen del grupo 3′-OH necesario para formar el siguiente enlace fosfodiéster; cuando se incorporan, la extensión se detiene. Se genera una familia de fragmentos que termina en cada posición posible.

La electroforesis capilar separa esos fragmentos por tamaño y un detector reconoce el fluoróforo terminal. El software produce un electroferograma con picos de colores y asigna una secuencia. Sanger y colaboradores publicaron el método de terminación enzimática en 1977 (PMID 271968). Su lógica sigue siendo central aunque los equipos actuales integren reacción, capilar y análisis automatizado.

La composición fue objeto de 2018, libre, pregunta 39: la plantilla oficial marcó A, la opción que reunía producto amplificado, ADN polimerasa, cebadores, nucleótidos y didesoxinucleótidos fluorescentes. En una reacción de secuenciación se utiliza habitualmente un cebador por dirección; «cebadores» en la opción describe el conjunto del proceso o reacciones directa e inversa, no dos cebadores simultáneos delimitando una PCR convencional.

12.2. Flujo analítico

Primero se obtiene una plantilla específica, a menudo mediante PCR. El producto se limpia para retirar cebadores y nucleótidos residuales. Se realiza una reacción de secuenciación para cada dirección, se purifican fragmentos marcados y se separan por capilar. Después se revisa calidad, alineación con referencia y concordancia entre lecturas.

En 2025, libre, pregunta 39, el SAS señaló como respuesta correcta A que Sanger requiere una única molécula homogénea de ADN, normalmente un producto específico de PCR. La formulación debe entenderse como una población homogénea de plantillas; una reacción contiene muchas copias. Si coexisten varios amplicones o alelos en proporciones complejas, los picos se superponen y la lectura se deteriora.

12.3. Interpretación del electroferograma

Una sustitución heterocigota germinal suele generar dos picos en la misma posición; una inserción o deleción heterocigota produce desfase y superposición desde el cambio. En tumor, la altura relativa depende de fracción tumoral, número de copias, amplificación y sesgo, por lo que no debe usarse como cuantificación exacta. Las regiones iniciales y finales de la lectura suelen tener peor resolución.

Debe revisarse orientación, calidad de bases, ruido, pull-up espectral, caída de señal, secuencias repetitivas y alineación. Una variante bajo el cebador puede causar caída alélica. Los pseudogenes pueden coamplificarse. Confirmar en dirección inversa aporta evidencia, pero no corrige una PCR que amplificó el locus equivocado.

12.4. Fortalezas y limitaciones

Sanger es adecuado para regiones pequeñas, variantes conocidas o confirmación, con lectura directa y costes razonables a baja escala. Su sensibilidad para poblaciones minoritarias es generalmente inferior a un NGS validado de alta profundidad. No existe un porcentaje universal: depende de señal, muestra, tipo de variante y procedimiento. Tampoco identifica bien alteraciones estructurales complejas ni cuantifica número de copias sin estrategias adicionales.

La convocatoria de 2021, libre, pregunta 29 marcó B: NGS puede identificar mutaciones presentes en un pequeño porcentaje de lecturas individuales. La opción que atribuía mayor sensibilidad a Sanger era falsa. La enseñanza no es que todo NGS sea más sensible, sino que la individualización y profundidad de lecturas permiten validar detección minoritaria.

13. SECUENCIACIÓN MASIVA Y BIOINFORMÁTICA

13.1. Concepto

La secuenciación masiva o NGS analiza en paralelo muchas moléculas individualizadas. En lugar de producir un único electroferograma compuesto, genera millones de lecturas asociadas a fragmentos de biblioteca. Esta arquitectura permite estudiar varios genes, detectar variantes minoritarias y combinar tipos de alteración, pero convierte el dato en una población estadística que requiere métricas, filtros y algoritmos.

La tecnología debe describirse por su finalidad, química, tipo de biblioteca, regiones y pipeline. «Se hizo NGS» es insuficiente. Un panel de amplicones de ADN, una captura híbrida, una biblioteca de ARN y una secuenciación genómica no tienen las mismas capacidades. El laboratorio valida la combinación completa y controla cambios de reactivos, software y versiones.

13.2. Preparación de la biblioteca

Una biblioteca es una colección de fragmentos de ADN o ADNc adaptados a la plataforma. La fragmentación puede ser física, enzimática o inherente al FFPE. Después se reparan extremos cuando corresponde y se ligan adaptadores que permiten amplificación, inmovilización y lectura. Los índices o barcodes identifican muestras multiplexadas; los identificadores moleculares únicos etiquetan moléculas originales para reconocer duplicados y modelar errores.

La cuantificación y distribución de tamaños de la biblioteca determinan la carga de la corrida. Una biblioteca escasa puede generar poca cobertura; una concentración excesiva puede perjudicar separación de señales en algunas plataformas. Los índices deben diseñarse para reducir asignación errónea y las muestras deben equilibrarse según rendimiento esperado, no solo por volumen.

13.3. Enriquecimiento dirigido

Los paneles clínicos suelen ser dirigidos. En amplicones multiplex, pares de cebadores amplifican regiones predefinidas. Requieren poco ADN, son rápidos y alcanzan gran profundidad, pero pueden sufrir caída de amplicón y tienen límites para regiones complejas o variantes estructurales. En captura híbrida, sondas capturan fragmentos que cubren regiones diana; ofrece diseño más flexible y puede recuperar regiones adyacentes o reordenamientos, a costa de más material y complejidad.

En 2022, extraordinaria, pregunta 22, las tres afirmaciones eran correctas y la respuesta oficial fue D: la mayoría de paneles clínicos de NGS son dirigidos; seleccionar genes mejora profundidad, coste y comunicación; y el enriquecimiento puede realizarse mediante captura híbrida o PCR multiplex. Es una síntesis excelente de la estrategia de panel.

13.4. Secuenciación y tipos de lectura

Las plataformas de lectura corta registran incorporación o cambios fisicoquímicos durante síntesis clonal. Una lectura puede obtenerse desde un extremo o desde ambos —paired-end—, lo que ayuda a mapear y reconocer inserciones o reordenamientos. Las plataformas de molécula única y lectura larga permiten atravesar regiones extensas, isoformas y variantes estructurales, pero presentan perfiles de error, rendimiento y validación diferentes.

La elección no debe basarse solo en longitud. Importan exactitud por base, número de lecturas, tiempo, coste, necesidad de amplificación, acceso a material y software. Un laboratorio puede combinar lectura corta muy profunda para variantes somáticas con lectura larga para problemas estructurales; cada finalidad exige controles propios.

13.5. Cobertura, profundidad y frecuencia alélica

Profundidad es el número de lecturas que cubre una posición. Cobertura también puede expresar la proporción de regiones objetivo que alcanza una profundidad definida. Por eso hay que declarar la métrica completa: «500× medio» no garantiza que cada exón alcance el mínimo. La uniformidad describe cómo se distribuyen las lecturas y los duplicados indican lecturas no independientes derivadas de una misma molécula.

En 2022, extraordinaria, pregunta 18, la definición examinada fue directa: número de lecturas obtenidas en una posición de un nucleótido = cobertura, respuesta oficial C. En terminología técnica puede denominarse profundidad de cobertura; el informe interno debe evitar ambigüedad.

La frecuencia alélica de variante —VAF— es la proporción de lecturas informativas que contienen una variante. No equivale a porcentaje de células tumorales. Pureza, heterocigosidad, número de copias, subclonalidad, sesgo de captura y duplicados la modifican. Una VAF baja puede ser verdadera o artefactual; debe superar criterios validados y ser compatible con dirección, calidad, contexto y soporte molecular independiente.

13.6. Pipeline bioinformático

El análisis primario convierte la señal en bases y asigna puntuaciones de calidad; el desmultiplexado separa muestras por índice. El análisis secundario alinea lecturas a un genoma de referencia o las ensambla, procesa duplicados y llama variantes. El análisis terciario anota consecuencias, frecuencias poblacionales, bases de datos, evidencia clínica y clasificación. Estas fronteras son operativas, pero ayudan a localizar errores.

El alineamiento puede ser ambiguo en pseudogenes, homopolímeros y regiones repetitivas. Los llamadores tienen modelos diferentes para sustituciones, indels, número de copias, fusiones e inestabilidad. Un pipeline validado para variantes puntuales no queda automáticamente validado para todas ellas. Roy y colaboradores publicaron en 2018 recomendaciones AMP/CAP para validar pipelines bioinformáticos de NGS oncológico (PMID 29154853).

13.7. Tipos de variante

Las sustituciones e indels pequeños se llaman a partir de discrepancias con la referencia. El número de copias se infiere comparando profundidad normalizada con muestras de referencia y, cuando está disponible, balance alélico. Las fusiones pueden detectarse en ADN mediante pares discordantes y lecturas partidas o en ARN mediante uniones expresadas. El ARN facilita demostrar la fusión funcional, pero depende de expresión e integridad.

La inestabilidad de microsatélites puede evaluarse comparando loci repetitivos con un modelo tumoral o con normal pareado, según ensayo. La carga mutacional requiere una región suficientemente amplia, definición de variantes contadas y calibración; no debe extrapolarse entre paneles sin validación. Las firmas y clasificadores requieren algoritmos y cohortes de referencia versionados.

13.8. Artefactos y confirmación

Los artefactos proceden de FFPE, PCR, secuenciación, alineamiento y contaminación. Orientación de lecturas, posición dentro de la lectura, calidad de base, contexto de secuencia, soporte en ambas cadenas y comparación con controles ayudan a reconocerlos. Los identificadores moleculares pueden agrupar lecturas por molécula original y reducir errores, pero no corrigen selección tumoral ni errores sistemáticos previos al etiquetado.

La confirmación ortogonal se decide durante validación. No todas las variantes de un ensayo bien validado necesitan confirmación rutinaria, pero hallazgos cercanos al límite, inesperados, con posible implicación germinal o en regiones problemáticas pueden requerir repetir extracción, usar otra muestra o aplicar un método distinto. La recomendación de Jennings y colaboradores para validar paneles NGS oncológicos enfatiza finalidad, precisión, sensibilidad, especificidad y monitorización continua (2017; PMID 28341590).

14. VALIDACIÓN, INTERPRETACIÓN, INFORME Y CALIDAD

14.1. Finalidad de uso y validación

La validación demuestra que un ensayo cumple requisitos para una finalidad concreta antes de utilizarlo. Debe definir muestras, analitos, genes y regiones, tipos de variante, rango, precisión, exactitud, sensibilidad analítica, especificidad, límite de detección, robustez e interferencias. En un método comercial, el laboratorio verifica el desempeño local; si modifica sustancialmente la finalidad o el procedimiento, necesita una evaluación proporcional.

El límite de detección no es una cifra universal de la plataforma. Depende del tipo de variante, contexto, profundidad independiente, entrada, calidad, pipeline y regla de llamada. Puede ser distinto para SNV, indel, fusión o número de copias. Debe estimarse con réplicas alrededor del límite y expresarse de forma que el clínico entienda qué negativo puede excluirse.

14.2. Materiales de referencia y controles

La validación combina muestras clínicas caracterizadas, líneas celulares, materiales sintéticos y referencias certificadas. Un control sintético es reproducible pero puede no reproducir extracción, fijación, matriz o complejidad. Las diluciones deben conservar el contexto cuando se evalúan frecuencias bajas. Las variantes negativas y regiones difíciles son tan importantes como los positivos.

En rutina se incluyen controles según tecnología: blanco de extracción, control sin molde, positivo, control interno, normal o calibrador, controles de conversión para metilación y métricas de corrida. El control de calidad externo compara desempeño con otros laboratorios. El Libro Blanco de la SEAP 2025 y sus programas de calidad sitúan interpretación e informe molecular dentro de un sistema profesional, no como una actividad aislada del servicio.

14.3. Cambios y revalidación

Reactivos, lote, extractor, termociclador, secuenciador, genes, algoritmo, referencia genómica, transcritos y bases de datos pueden cambiar. El laboratorio evalúa impacto antes de implementar y define qué verificación o revalidación necesita. Un cambio de software puede modificar llamadas aun con los mismos archivos brutos; conservar versión y parámetros es obligatorio.

14.4. Nomenclatura e interpretación

La nomenclatura HGVS describe variantes respecto a una secuencia de referencia y transcrito concretos. Deben indicarse accesión y versión cuando sean relevantes. Una descripción correcta no establece patogenicidad. En germinal, las recomendaciones ACMG/AMP de 2015 utilizan cinco categorías: patogénica, probablemente patogénica, significado incierto, probablemente benigna y benigna (PMID 25741868).

En oncología somática, las recomendaciones AMP/ASCO/CAP de 2017 organizan la evidencia por significado clínico y distinguen niveles de acción/evidencia (PMID 27993330). Las bases de datos se actualizan y pueden discrepar. La clasificación debe indicar evidencia, fecha y contexto tumoral; no se copia automáticamente una etiqueta sin comprobar enfermedad, variante, nivel y fuente.

Un resultado tumoral no establece origen germinal. Una VAF compatible puede suscitar sospecha, pero pureza y número de copias impiden inferirla. Si existe implicación hereditaria, debe recomendarse evaluación y confirmación en muestra normal adecuada con consentimiento y circuito de genética.

14.5. Contenido del informe

El informe identifica paciente y muestra, diagnóstico o área analizada, proporción tumoral estimada, método, genes/regiones o panel, referencia, resultado, nomenclatura, interpretación, calidad relevante y limitaciones. Debe distinguir «no detectado» de «no evaluable». Si una región crítica no alcanzó criterios, no puede quedar oculta dentro de un panel globalmente aprobado.

Para un positivo se informa significado en el contexto clínico y, cuando corresponde, evidencia terapéutica o diagnóstica conforme a guías vigentes. Para un negativo se explican tipos de alteración y límites del ensayo. No debe prometerse exclusión de variantes por debajo del límite, en regiones no cubiertas o de clases no validadas.

14.6. Bioseguridad, datos y ética

El laboratorio maneja muestras humanas, reactivos peligrosos y datos genéticos. Debe aplicar procedimientos de bioseguridad, confidencialidad, acceso, retención y copia de seguridad. Los archivos NGS pueden contener información más amplia que la solicitada. La política sobre hallazgos incidentales, datos germinales y reutilización debe ajustarse al marco asistencial y legal.

La competencia del personal incluye formación continua, evaluación, participación en calidad externa y revisión de discrepancias. ISO 15189:2022 exige gestionar documentos, equipos, incidencias, riesgo y mejora. La calidad no consiste en acumular controles, sino en detectar a tiempo cuándo el resultado no puede emitirse con confianza.

15. SELECCIÓN DEL MÉTODO Y ALGORITMOS INTEGRADOS

La selección se inicia con el tipo de alteración. Una variante puntual recurrente puede estudiarse por PCR alelo-específica, dPCR, Sanger o NGS; una deleción multiexónica por MLPA, qPCR, array o NGS de copias; una fusión por FISH, RT-PCR, ARN-NGS o captura de ADN; una metilación por MSP, MS-HRM, pirosecuenciación o array. La mejor opción equilibra cobertura, sensibilidad, material, tiempo, coste, experiencia y acción clínica.

También importa la amplitud de la pregunta. Si solo una variante determina una decisión urgente, un ensayo dirigido puede ser más eficiente. Si múltiples genes, exones y clases de alteración son relevantes y el tejido es escaso, un panel integrado conserva material. Un método amplio puede producir más variantes inciertas y necesitar más bioinformática; uno estrecho puede requerir series de pruebas y agotar muestra.

15.1. ADN frente a ARN

ADN es relativamente estable y permite variantes, copias y reordenamientos. ARN demuestra transcritos expresados, simplifica intrones y puede resolver fusiones con parejas diversas, pero se degrada y depende de expresión. Para una fusión, un ensayo de ADN puede señalar el reordenamiento aunque el punto de rotura esté en un intrón difícil; un ensayo de ARN puede demostrar la unión funcional pero fallar si el transcrito es escaso. Usarlos de forma complementaria aumenta rendimiento en casos seleccionados.

15.2. Método dirigido frente a método exploratorio

La PCR dirigida ofrece gran sensibilidad para una lista cerrada. Sanger lee una región corta sin limitarse a una sola sustitución, pero necesita una población suficiente. NGS dirigido amplía genes y variantes en paralelo. Genoma, exoma, transcriptoma y metiloma responden preguntas más abiertas y requieren mayor capacidad analítica. La amplitud debe estar justificada por utilidad clínica, no por disponibilidad tecnológica.

15.3. Técnica molecular frente a contexto tisular

FISH e hibridación in situ conservan arquitectura y muestran qué células albergan la señal; PCR y NGS mezclan el material de la región extraída. La IHQ puede ser un cribado rápido o un biomarcador por sí misma, pero mide proteína y depende de anticuerpo e interpretación. Las discordancias pueden reflejar biología, heterogeneidad, umbral o error y deben resolverse con un algoritmo definido.

15.4. Algoritmo práctico

1. Define la decisión: diagnóstico, pronóstico, terapia, herencia o monitorización.
2. Revisa la morfología: identidad, representatividad, tumor, necrosis y heterogeneidad.
3. Selecciona analito: ADN, ARN, metilación, proteína o señal in situ.
4. Compara con rendimiento: cantidad/calidad esperadas frente a entrada y límite validados.
5. Elige amplitud: diana única, panel o enfoque amplio.
6. Planifica controles y rescate: qué invalida, qué se repite y qué método ortogonal se reserva.
7. Informa con contexto: resultado, significado, regiones evaluables y limitaciones.

16. CLAVES DE EXAMEN Y PERLAS OFICIALES SAS

Las siguientes perlas se han cruzado con las plantillas definitivas de las convocatorias aportadas. Se citan convocatoria, número y letra oficial. No se atribuye al tribunal una explicación que no figura en el examen: el razonamiento añadido es docente. Se consideran cuatro convocatorias únicas —2018, 2021, 2022 y 2025—; el archivo 2022 APES duplica la extraordinaria y el proceso interno de 2018 solapa casi por completo el turno libre, por lo que no se cuentan otra vez.

16.1. Estructura, flujo de información y epigenética

16.2. PCR, electroforesis y Sanger

16.3. NGS

16.4. Mapa de trampas rápidas

17. REFERENCIAS, VIGENCIA DE FUENTES Y PALABRAS CLAVE

17.1. Normas, documentos institucionales y guías

1. Junta de Andalucía. Orden de 30 de julio de 2024: programa de Facultativo/a Especialista de Área, especialidad Anatomía Patológica. BOJA núm. 156, 12 de agosto de 2024. Epígrafe oficial del Tema 32.
2. International Organization for Standardization. ISO 15189:2022. Medical laboratories — Requirements for quality and competence. 4.ª edición, 2022.
3. International Organization for Standardization. ISO 20166-1:2018. Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for formalin-fixed and paraffin-embedded tissue — Part 1: Isolated RNA. Confirmada en 2024.
4. International Organization for Standardization. ISO 20166-3:2018. Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for formalin-fixed and paraffin-embedded tissue — Part 3: Isolated DNA. Confirmada en 2024.
5. International Organization for Standardization. Serie ISO 21474: terminología y requisitos generales (2020), validación/verificación (2022) e interpretación e informes (2024) para procesos moleculares multiplex.
6. Clinical and Laboratory Standards Institute. MM09. Human Genetic and Genomic Testing Using Traditional and High-Throughput Nucleic Acid Sequencing Methods. 3.ª edición, 2023.
7. Sociedad Española de Anatomía Patológica. Libro Blanco de la Anatomía Patológica en España 2025. SEAP-IAP, 2025. Capítulos de Patología Molecular, interpretación, informe y calidad.
8. WHO Classification of Tumours Editorial Board. WHO Classification of Tumours, 5.ª edición. IARC, 2019-2026. Los criterios moleculares específicos deben comprobarse en el volumen y versión de cada órgano.
9. National Human Genome Research Institute. Deoxyribonucleic Acid (DNA) Fact Sheet, 2020; Ribonucleic Acid (RNA) Fact Sheet, actualización 2024; Polymerase Chain Reaction (PCR) Fact Sheet, actualización 2025.
10. College of American Pathologists. Molecular Pathology Checklist y materiales de práctica NGS, versiones vigentes consultadas en agosto de 2026.

17.2. Artículos metodológicos fundamentales

1. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 1977;74:5463-5467. PMID 271968.
2. Saiki RK, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239:487-491. PMID 2448875.
3. Brown T. Southern blotting. Curr Protoc Immunol. 2001. PMID 18432697.
4. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Proc Natl Acad Sci USA. 1979;76:4350-4354. PMID 388439.
5. Bustin SA, et al. MIQE 2.0: revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments guidelines. 2025. PMID 40272429.
6. Huggett JF, et al. The digital MIQE guidelines update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. Clin Chem. 2020;66:1012-1029. PMID 32746458.
7. Vogelstein B, Kinzler KW. Digital PCR. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96:9236-9241. PMID 10430926.
8. Notomi T, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28:E63. PMID 10871386.
9. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 1991;350:91-92. PMID 1706072.
10. Schouten JP, et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 2002;30:e57. PMID 12060695.
11. Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR. Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93:9821-9826. PMID 8790415.
12. Wojdacz TK, Dobrovic A. Methylation-sensitive high resolution melting. Nucleic Acids Res. 2007;35:e41. PMID 17289753.
13. Do H, et al. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by uracil-DNA glycosylase. Clin Chem. 2013;59:1376-1383. PMID 22643842.
14. Wong SQ, et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. 2014. PMID 25421801.
15. Singh VM, et al. Effect of decalcification agents on immunohistochemistry and molecular analyses. J Clin Pathol. 2013. PMID 23660273.

17.3. Recomendaciones de secuenciación e interpretación

1. Jennings LJ, et al. Guidelines for Validation of Next-Generation Sequencing-Based Oncology Panels: AMP/CAP consensus recommendation. J Mol Diagn. 2017;19:341-365. PMID 28341590.
2. Roy S, et al. Standards and Guidelines for Validating Next-Generation Sequencing Bioinformatics Pipelines: AMP/CAP joint recommendation. J Mol Diagn. 2018;20:4-27. PMID 29154853.
3. Li MM, et al. Standards and Guidelines for the Interpretation and Reporting of Sequence Variants in Cancer: AMP/ASCO/CAP consensus recommendation. J Mol Diagn. 2017;19:4-23. PMID 27993330.
4. Richards S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: ACMG/AMP joint consensus. Genet Med. 2015;17:405-424. PMID 25741868.
5. den Dunnen JT, et al. HGVS Recommendations for the Description of Sequence Variants: 2016 update. Hum Mutat. 2016;37:564-569. PMID 26931183.

17.4. Palabras clave